大鼠外傷性視神經病變后GAP-43表達的變化

劉曉坤 羅鋼 趙平

·論著·

大鼠外傷性視神經病變后GAP-43表達的變化

劉曉坤 羅鋼 趙平

目的研究大鼠視神經夾挫傷后視神經和視網膜神經節細胞(retinal gangliocytes，RGCs)形態學及生長相關蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)表達的變化。方法采用大鼠球后視神經鉗夾傷模型，分別于損傷后1、4、7、14、28d處死動物，HE染色觀察視神經組織及RGCs的動態改變，免疫組化方法檢測視神經軸突GAP-43的表達變化。結果視神經損傷后，RGCs數目明顯下降，14d內降低速度較快，14d后下降速度減慢；與正常大鼠視神經軸突相比，GAP-43表達明顯增加，傷后14d達峰值，14d后逐漸下降(P<0.05)。結論視神經損傷后RGCs數量減少是其視功能下降的病理基礎之一，視神經軸突GAP-43表達增加是視神經損傷修復的一種表現。

外傷性視神經病變；視網膜神經節細胞；生長相關蛋白

外傷性視神經病變是臨床上常見的致盲性眼病。視神經由RGCs的軸突組成，為中樞神經系統的一部分。一系列的動物模型研究證實視神經損傷后視功能下降的病理基礎是以RGCs的繼發性喪失為主的。GAP-43是一種神經特異性的質膜磷酸蛋白，廣泛分布于生長、發育中的胚胎神經系統中。神經系統發育成熟后其表達水平變得很低甚至消失，于神經系統損傷后的修復再生過程中重新表達，被認為是神經生長發育和再生的分子標記物[1，2]。本實驗通過建立大鼠視神經夾挫傷模型，觀察傷后視神經、RGCs的形態學變化及視神經軸突中GAP-43的變化，為研究視神經損傷后變化規律及視神經損傷的再生修復提供了分子病理學基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用清潔級健康成年Sprague-Dawley大鼠36只(36眼)，雌性，體重230～250 g，由河北醫科大學實驗動物中心提供。健康無眼疾，實驗期間由河北醫科大學第三醫院動物實驗中心代養。隨機分為正常組(6只6眼)，損傷組(30只30眼)。損傷組再按損傷后存活的時間隨機分為1、4、7、14d和28d 5組，每組6只。每只動物左眼為實驗眼，右眼為假傷眼。

1.2 視神經損傷動物模型制作 腹腔注射6 g/L戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉。固定于俯臥位。沿角膜緣剪開鼻側球結膜，分離并暴露視神經。于球后2 mm處用壓力恒定的反向鑷夾持視神經，致傷時間分別為20 s，同時觀察大鼠眼底血液供應情況，避免損傷眼動脈。注意反向鑷尖與視神經的長軸垂直。松開反向鑷后，縫合球結膜。致傷眼直接對光反應消失，瞳孔散大固定；檢眼鏡觀察眼底，視網膜血管無出血與梗塞者為成功制作之動物模型，術后結膜囊內涂紅霉素眼膏。

1.3 取材 正常對照組于損傷后4d取材，損傷組分別于損傷后1、4、7、14d和28d 5個時間點取材。6 g/L戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉(60 mg/kg)，開胸，經左心室插管，灌注0.9%氯化鈉溶液，沖凈血液，再灌注4℃ 40 g/L的多聚甲醛磷酸緩沖液250 ml，先快后慢，持續30 min。去除眶外側和眶上側骨壁，取大鼠眼球和視神經(直至視交叉處，以判斷損傷遠近端)。

1.4 視神經與視網膜光鏡切片的制備 40 g/L多聚甲醛固定，依次梯度乙醇脫水、透明、包埋，冠狀面4 μm連續切片。常規HE染色。光學顯微鏡下觀察視神經和視網膜的形態學改變。在Motic Med 6.0 數碼醫學圖像分析系統內在相同的放大倍數(200 倍)下，每個標本計數 3 張切片，每個切片計數 3 個視野。

1.5 免疫組織化學檢查 GAP-43免疫組化染色嚴格按照SP試劑盒說明操作。每組每個時間點分別選取6張切片，采用Motic Med 6.0數碼醫學圖像分析系統，統一的放大倍數，隨機檢測3個區域(150 μm×200 μm)平均光密度值(average opticaldensity，AOD)。每標本數據取其均值。

2 結果

2.1 HE染色的視網膜切片形態學觀察和 RGCs 計數

2.1.1 正常組：視網膜層次清晰，神經纖維層嗜伊紅性紅染，RGCs 呈單層排列，胞核較大，大小不一，呈圓形或橢圓形，染色較濃，排列整齊；內核層胞核較大，染色較深，外核層胞核較小，染色深，排列較緊密。

2.1.2 損傷組：1、4d同正常組相比視網膜形態無明顯改變；7d時，神經纖維層變薄，內核層及外核層變薄，細胞的數目減少，排列紊亂，RGC 層部分胞核體積縮小，染色加深，呈核固縮形態；14d時上述病理改變加重；28d時，RGC 層排列明顯稀疏，數目減少明顯，較多細胞核體積縮小，染色加深，呈核固縮形態，神經纖維層變薄，內核層及外核層明顯變薄，細胞排列紊亂。

2.1.3 RGCs計數：1、4d時，2組 RGCs 個數的差異無統計學意義(P>0.05)；4d后損傷組RGCS數目呈下降趨勢，7、14、28d與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組大鼠RGCs計數

組別RGCs計數正常組30.5±2.1損傷組 1d30.2±2.1 4d29.5±2.1 7d18.4±2.3* 14d13.2±2.1* 28d10.2±1.4*

注：與正常組比較，*P<0.05

2.2 HE 染色的視神經切片形態學觀察

2.2.1 正常組：視神經：橫切面類似圓形，神經纖維束排列均勻呈柱形，神經纖維排列整齊，散在膠質細胞，無炎性細胞浸潤及組織的水腫、壞死，染色均勻。

2.2.2 損傷組：1d視神經纖維束腫脹，散在的神經纖維空泡樣變性；4d視神經纖維束腫脹加重，神經纖維可見空泡樣變性，細胞水腫，少數細胞核出現固縮；7d視神經纖維束腫脹，可見片狀神經纖維空泡樣變性，細胞明顯水腫，部分細胞核固縮；14d視神經纖維束腫脹，可見大片神經纖維空泡樣變性，形成大空泡，細胞明顯水腫，較多的細胞核固縮；28d視神經纖維束腫脹稍減輕，大片神經纖維空泡樣變性，大空泡較多，細胞水腫較前減輕，較多細胞核固縮。

2.3 GAP-43 免疫組化 免疫組化結果判斷：(-)無著色；(+)淺黃色；(++)黃色；(+++)深黃色；(++++)深棕黃色。

2.3.1 正常組免疫組化(-)。

2.3.2 損傷組：1d時損傷近端及遠端GAP-43 蛋白表達均不明顯，無著色(-)；4d，7d時損傷近端 GAP-43 蛋白表達陽性，均呈黃色(++)，遠端(-)；14d時損傷近端 GAP-43 表達陽性減弱，呈淺黃色(+)，損傷遠端局灶性陽性表達，呈黃色(++)；28d時損傷近端及遠端GAP-43 蛋白表達微弱，呈淺黃色(+)。

2.3.3 大鼠視神經損傷后4d、7d、14d、28d時GAP-43蛋白表達：平均光密度分別為：(0.0198±0.0020)、(0.0890±0.0180)、(0.2761±0.0281)、(0.2112±0.0331)。

3 討論

視神經損傷多導致嚴重視功能障礙甚至永久失明。Walsh[3]二次損傷學說認為視神經損傷可分為原發性損傷和繼發性損傷，是目前較為公認的外傷性視神經損傷機制。實驗研究及臨床觀察認為，眼外傷后10 min內出現的視敏度下降或視力喪失為原發性損傷，而數十分鐘、數小時或數日后出現的視力損害為繼發性損傷，視神經缺血和水腫相互加重使有恢復潛能的神經元進一步喪失。本實驗觀察到，視神經損傷在光鏡下的主要表現為神經纖維空泡樣變性和視神經纖維束的腫脹，隨著時間推移呈不同程度的交錯變化過程。神經纖維束的腫脹造成視神經管內的視神經受壓并加重視神經損傷。視神經局部損傷合并缺血缺氧，造成局部能量代謝障礙，ATP 含量減少，使視神經的通透性和組織液含量增加，從而造成軸突的腫脹以及髓鞘的松解。軸突變性和髓鞘脫失造成視功能的進一步喪失，使視力障礙變為不可逆。所以通過藥物或手術等干預措施保護原發性損害后尚存活的神經元，防止或減少繼發性損害，保持殘余視力并促進視力恢復，是治療視神經損傷的目的。

本實驗觀察到傷后7d，損傷組可見 RGCs 層部分胞核體積縮小，染色加深，呈核固縮形態，視神經纖維層變薄，內核層及外核層變薄，細胞排列紊亂。傷后 14、28d，損傷組神經纖維層，內核層及外核層明顯變薄，仍可見核固縮改變。統計分析結果顯示視神經損傷后的 RGCs 數是一個逐漸下降的過程。隨著傷后時間的延長RGCs數目明顯減少，傷后7d，RGCs退變死亡速度加快，傷后7～14d RGCs 密度減少最明顯，到14d至28d RGCs 減少較前稍趨緩和。提示在視神經外傷后，RGCs的喪失與時間有明顯相關性。與蔡莉等[4]兔視神經挫傷的病理研究結果相似。出現這一結果的原因，可能是由于傷后2周內以原發性損傷為主，而2周以后則是繼發性損傷起主要作用，而原發性損傷已不明顯。

視神經纖維與RGCs 兩者之間變化基本一致，但是視神經纖維損傷變化出現相對于 RGCs 早。損傷4d光鏡下視神經纖維數目就有明顯差異，而RGCs 在7d后才見差別。提示視神經損傷后神經纖維較 RGCs 的變化早，可能為視神經損傷后軸突仍有少量靶細胞分泌的逆行性神經營養因子，延緩了RGCs 的死亡，待神經營養因子消耗殆盡后，RGCs 就會大量死亡，這也與本實驗中觀察到7d時 RGCs 加速死亡一致。

GAP-43 是一種神經特異性的質膜磷酸蛋白，廣泛存在于胚胎神經系統中，特別是在軸突末端含量極高，一旦神經系統發育成熟，GAP-43 的表達水平迅速下降甚至消失，但會神經系統損傷后的修復再生過程中重新表達。GAP-43蛋白的合成與表達直接與軸突生長能力呈正相關，可以代表軸突生長能力，被認為是神經生長發育和再生的分子標記物[5，6]。現已認為GAP-43的表達增高是神經系統尤其是中樞神經系統再生的一個特征[7-10]。越來越多研究報道表明 GAP-43與視神經損傷及再生密切相關，損傷蟾蛛視神經纖維，其RGCs內的 GAP-43在損傷后第4天開始升高，14d達到高峰，到21d視神經長入靶組織后，GAP-43的水平開始逐漸下降。大鼠視神經切斷后坐骨神經段吻合，玻璃體腔內同時植入坐骨神經段，傷后3d RGCs 就出現了GAP-43的陽性表達并可持續到8周。以上研究表明 GAP-43是視神經再生的特征性的證據。本實驗結果顯示視神經損傷后7d損傷近端GAP-43有強陽性表達，此為視神經對損傷的反應。視神經軸突受損傷后，啟動了一系列RGCs胞體的反應，包括核質的增加，核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)及蛋白合成的啟動等，伴隨有軸突生芽而引發的 GAP-43的重新表達，在再生中起十分重要的作用。損傷造成了視神經生存環境和正常生理結構的破壞，這便刺激了GAP-43在損傷早期的高表達，而后者立即成為引發修復再生反應的始動因素，也可以說為視神經以后再生打下了物質基礎。

本實驗結果提示視神經損傷至 RGCs 大量死亡之間存在著間期，GAP-43蛋白表達水平也表現出一定的時間相關性。在此期間如能夠給予及時有效的治療，搶救原發損傷后存留的神經元，防止及減少繼發性損害，減少死亡細胞數目，促進視神經軸突的再生，使其恢復正常結構功能，最終促使視神經功能的恢復。因此早期治療是影響視神經損傷治療預后的一個重要因素。

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2 Kaneda M，Nagashima M，Nunome T，et al.Changes of phospho-growth-associated protein 43(phospho-GAP43) in the zebrafish retina after optic nerve injury: a long-term observation.Neurosci Res，2008，61:281-288.

3 Walsh FB.Pathological-clinic correlations.Indirect trama to the optic nerves and chiasm.11.Certain cerebral involvement associated withdefective blood supply.Invest Ophthalmo，1966，5:433-449.

4 蔡莉，惠延年，馬吉獻，等.兔視神經挫傷的實驗研究.眼外傷職業眼病雜志，2000，22:125-126.

5 Dinocourt C，Gallagher SE，Thompson SM.Injury-induced axonal sproutingin the hippocampus is initiated by activation of trkB receptors.Eur J Neurosci，2006，24:1857-1861.

6 Stroemer RP，Kent TA，Hulsebosch CE.Neocortical neural sprouting，synaptogenesis，and behavioral recovery after neocortical infarction in rats.Stroke，1995，26:2135-2144.

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ThechangesofGAP-43inratswithtraumaticopticneuropathy

LIUXiaokun，LUOGang，ZHAOPing.DepartmentofOphthalmology，TheThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity，Shijiazhuang050051，China

ObjectiveTo observe the changes in morphology of optic nerve and retinal gangliocytes(RGCs) as well as the expression levels of growth associated protein-43 (GAP-43) in rats with optic nerve contusion.MethodsIntraorbital optic nerve contusion models in rats were established，and the animals were executed at.1，4，7，14 and 28days after injury.The morphological changes in optic nerve tissue and RGCs were observed through HE staining.The expression levels of GAP-43 in optic nerve axons weredetected by immunohistochemistry.ResultsThe number of RGCs was reduced significantly after optic nerve injury，and the speed of reduction was quicker within 14days.As compared with those in normal optic nerve axon，the expression levels of GAP-43 were significantly increased in injury group，which peaked at 14days after injury and graduallydecreased after14days.ConclusionThedecrease of RGCs number after optic nerve injury is one of the pathological mechanisms of visual function lesion.The increase of GAP-43 expression in the optic nerve axons is a kind of injury repairing phenomenon.

traumatic optic neuropathy；retinal gangliocytes；growth associated protein-43

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.17.002

項目來源：河北省醫學科學研究重點課題(編號：20110404)

050051 石家莊市，河北醫科大學第三醫院眼科

R 774

A

1002-7386(2014)17-2568-03

2014-02-11)