維生素C對靜脈鐵劑誘導的外周血單個核細胞凋亡的干預作用

張紅強，李丹妮，陳 建

(重慶第三軍醫大學附屬新橋醫院 腎內科 血液凈化中心，重慶，400037)

鐵缺乏在慢性腎臟病患者，特別是接受維持性血液透析(MHD)的患者中很常見，是導致腎性貧血的重要原因之一。而腎性貧血是促進慢性腎衰竭進展、增加心腦血管并發癥的發生率及病死率的重要危險因素[1]。靜脈鐵劑和口服鐵劑都能改善這種鐵缺乏狀態，且前者療效更顯著，副作用小，臨床用藥相對方便，所以靜脈鐵劑的臨床應用更為廣泛[2-3]。但是二者都會加重MHD患者體內的氧化應激狀態，進而加劇微炎癥狀態[4]、感染、心血管并發癥[5]等的發生。已有臨床報道[6]稱口服或靜脈補充維C[7]都可以減輕補鐵劑誘導的MHD患者氧化應激狀態。

HPBMC即外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞，發揮細胞免疫功能。HPBMC易被細胞因子和線粒體氧化損傷激活，進而ROS生成量增多并發生凋亡，這是造成MHD患者外周血免疫細胞數量減少，免疫功能缺陷的重要原因之一[8]。在進行MHD治療時常用靜脈鐵劑來糾正患者鐵缺乏，增加鐵儲備，研究發現這同時也發現其會加重MHD患者體內的氧化應激狀態[9]。這是否跟靜脈鐵劑對MHD患者外周血單核細胞(HPBMC)氧化應激加劇和細胞凋亡的影響有關尚不清楚，因此本研究使用靜脈鐵劑處理體外培養的MHD患者HPBMC，并使用維C進行干預，探索靜脈鐵劑對HPBMC的氧化應激和細胞凋亡的影響以及維C對此的干預作用。

1 資料與方法

1.1 主要儀器與試劑

流式細胞儀(BD FACS ARIA，美國)，Western blot成像儀(Carestream Health，美國)，多功能酶標儀(Beckman Coulter，美國)，4種靜脈鐵劑(西南藥業，重慶)，維生素C注射液(雙鶴藥業，北京)，單個核細胞分離液(灝洋生物科技，天津)，RPMI 1 640培養基(Hyclone，美國)，胎牛血清(Hyclone，美國)，Bax、Bcl-2一抗(Santa Cruz，美國)，HRP標記山羊抗兔二抗、Caspase-3的活性檢測試劑盒(碧云天，江蘇海門)，ROS Fluorescent Probe-DHE(Sigma，美國)，Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒(三箭生物科技，天津)。

1.2 HPBMC的分離與培養

取10 mL肝素鈉抗凝外周靜脈血按血：分離液按1∶2的比例緩慢注入人淋巴細胞分離液上層，400 g 20 ℃離心30 min，取白膜層細胞重懸于4倍體積的RPMI 1 640中，200 g，10 min離心洗細胞，重復2次。按1×106個/mL的濃度將細胞接種于含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI 1 640培養基中，加入植物血凝素(PHA)至終濃度300 μg/mL。

1.3 試驗分組與處理

按照上述方法培養24 h，然后更換為不含PHA的1 640培養液，分為對照組，Is處理組，Id處理組，Fg處理組，Fc處理組，Id+維C干預組。4種靜脈鐵劑的濃度均為200 μg/mL，維C的終濃度為25 μmol/L。對照組給予1640培養基，Is、Id、Fg、Fc處理組分別給予含對應靜脈鐵劑的1 640培養基，培養8 h; Id+維C干預組先給予含Id的1640培養基培養2 h，再加入維C繼續培養至6 h。收集細胞進行后續實驗。

1.4 細胞凋亡率的檢測

使用Annexin V/PI雙染法檢測細胞凋亡率：收集細胞用孵育緩沖液洗滌1次，800 r/min離心5 min。用100 μL孵育緩沖液重懸細胞，加入5 μL FITC標記的抗Annexin V抗體，室溫下避光孵育10 min后加入5 μL PI染色5 min，染色結束后加入500 μL PBS以終止反應并上機檢測。

1.5 Western blot實驗

收集的細胞用RIPA 細胞裂解液裂解，超聲破碎后用12 000 g離心10 min，收集上清采用BCA法測定蛋白濃度，取蛋白樣品與5X蛋白上樣緩沖液混勻，95 ℃金屬浴5 min。配制并灌注12%的分離膠和5%濃縮膠，每孔上樣蛋白30 μg左右。80 V (30 min)，120 V (90 min)的電泳結束后采用濕轉法轉膜，300 mA (60 min)。轉膜結束后，用5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉1 h以上，加入一抗4 ℃孵育過夜。次日用TBST洗滌10 min 2次，加入HRP標記二抗室溫孵育2 h。再次TBXT 洗滌10 min 2次，ECL發光顯影。分別檢測Bax和Bcl-2，以及蛋白質上樣內參GAPDH的表達。結果用Quantity One凝膠圖像分析系統進行條帶的灰度分析。

1.6 Caspase-3的活性檢測

按照碧云天的Caspase-3的活性檢測試劑盒(C1115)說明書進行實驗。

1.7 細胞ROS陽性率的檢測

收集細胞，重懸細胞于孵育緩沖液中，加入ROS Fluorescent Probe-DHE至終濃度為2 μM，并置于37 ℃避光孵育15 min。孵育緩沖液洗滌細胞1次，800 r/min離心5 min，加入400 μL PBS重懸細胞并上機檢測。

1.8 統計學處理

2 結 果

2.1 流式細胞儀檢測細胞凋亡的結果

① 不同靜脈鐵劑對HPBMC細胞凋亡的影響: 4種靜脈鐵劑處理組的細胞凋亡率分別是Is (42.38±2.74)%，Id (40.51±2.13)%，Fg (41.79±2.82)%，Fc (40.47±1.97)%，均明顯高于對照組(20.13±1.16)%(P<0.01)，且4組之間無顯著差異(P>0.05)。見表1; ② 維C干預對Id誘導的HPBMC細胞凋亡的作用: Id+維C干預組的細胞凋率為(29.09±1.29)%，明顯低于Id處理組(40.51±2.13)%(P<0.05)。見表1。

2.2 Western blot分析結果

① Id對HPBMC促凋亡基因Bax，以及抗凋亡基因Bcl-2蛋白表達的影響(圖1): 采用Quantity One凝膠圖像分析系統分析雜交條帶的灰度值，結果顯示：Id處理組的Bax，Bcl-2蛋白表達量分別是對照組的(2.09±0.21)，(0.46±0.11)倍，(P<0.05); ② 維C干預對Id誘導Bax和Bcl-2蛋白表達的作用(圖1): Id+維C干預組的Bax，Bcl-2蛋白表達量分別是對照組的(1.13±0.25)，(0.87±0.16)倍，維C干預降低了凋亡基因Bax的表達，增加了抗凋亡基因Bcl-2的表達，(P<0.05)。

表1 不同靜脈鐵劑對HPBMC細胞凋亡率的影響及維C的干預作用 %

與CTRL比較，*P<0.05；與Id比較，#P<0.05。

2.3 Caspase-3的活性檢測結果

① Id對HPBMC凋亡分子Caspase-3活性的影響(圖2): 測得各組405 nm吸光度值后，與對照組相比，結果顯示：Id處理組的Caspase-3活性是對照組的(3.51±0.33)倍(P<0.05); ②維C干預對Id誘導的Caspase-3活化的作用(圖2): Id+維C干預組的Caspase-3活性是對照組的(1.87±0.26)倍，維C干預降低了凋亡分子Caspase-3的活性(P<0.05)。

2.4 流式細胞儀檢測HPBMC細胞ROS陽性率的結果

① Id對HPBMC細胞ROS陽性率的影響(圖3): Id處理組的細胞ROS陽性率為(68.32±4.57)%，明顯高于對照組(42.87±4.05)%(P<0.05); ② 維C干預對Id誘導的細胞ROS生成量增加的作用(圖3): Id+維C干預組的細胞ROS陽性率為(53.79±4.11)%，明顯低于Id處理組(68.32±4.57)%(P<0.05)。

圖2 Id對HPBMC凋亡分子Caspase-3的影響及維C的干預作用

3 討 論

鐵是十分重要的微量元素，參與構成多種活性酶，也是血紅蛋白中O2的載體。但是MHD患者由于攝入不足、透析過程中丟失、胃腸道慢性失血等原因，常出現缺鐵性貧血[10]，因而臨床上常采用靜脈鐵劑給其補鐵。但是靜脈補鐵后，體內游離鐵增加，通過Fenton /Haber-Weiss反應催化產生代表ROS的羥基和烷氧基，觸發脂質過氧化，引起氧化應激反應加劇，促進微炎癥狀態，感染等并發癥的發生發展[11-12]。臨床研究[13]發現，口服或靜脈補充維C，以及使用維C透析液都可以減輕補鐵劑誘導的MHD患者氧化應激狀態。目前，靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激以及使用抗氧化劑維C對此進行干預都體現在患者體內氧化應激一系列指標的改變上，尚沒有做深入研究。本研究采用體外培養的MHD患者HPBMC，探索靜脈鐵劑對其凋亡的影響以及維C對此過程的干預作用，欲探索靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激，促進微炎癥狀態，感染等并發癥的發生發展的內在機制是否與HPMBC的凋亡有關。

A為對照組; B為Id處理組; C為Id+維C干預組

HPMBC主要包括T、B淋巴細胞及少量單核細胞，其增殖與凋亡之間的動態平衡是維持人體正常防御與監視功能的保證。研究[14]發現，HPBMC的凋亡與MHD患者細胞免疫功能缺陷密切聯系。細胞凋亡是細胞死亡的形式之一，凋亡早期，位于細胞膜內側的磷酯酰絲氨酸(PS)可遷移至細胞外側， Annexin V可與PS發生特異性結合，是目前流式細胞定量檢測細胞凋亡的首選方法。本研究采用此法發現4種靜脈鐵劑處理的MHD患者HPMBC后，其凋亡率顯著高于對照組(表1)，證實靜脈鐵劑可誘導MHD患者HPMBC的凋亡，與文獻[15]報道相一致。進一步采用Western blotting分析法和Casepase-3活性檢測試劑盒檢測發現靜脈鐵劑Id處理的HPBMC細胞促凋亡因子Bax表達增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表達減少(圖1)，凋亡分子Casepase-3被激活(圖2)，說明靜脈鐵劑處理會激活HPBMC細胞內的凋亡信號。這些結果都證實，靜脈鐵劑能夠誘導MHD 患者HPBMC的細胞凋亡。

作為免疫細胞，HPBMC易被細胞因子和線粒體氧化損傷所激活，ROS生成量增多，凋亡信號激活，進而發生凋亡，這提示靜脈鐵劑對HPBMC凋亡的誘導可能與其促進細胞氧化應激和線粒體氧化損傷有關。故本研究探索了靜脈鐵劑對HPBMC細胞ROS生成量的影響，FCM檢測結果發現Id處理的HPBMC細胞ROS陽性率明顯高于對照組(圖3)，證實了靜脈鐵劑能加劇HPBMC的氧化損傷程度。鑒于維C在臨床上用于改善靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激狀態，本研究進一步探索了維C對靜脈鐵劑誘導的HPBMC的氧化應激和細胞凋亡的干預作用。結果發現維C干預能使Id處理的HPBMC細胞促凋亡因子Bax表達下調，抗凋亡蛋白Bcl-2表達增加(圖1)，凋亡分子Casepase-3活性下降(圖2)，ROS生成量減少(圖3)，最終抑制了靜脈鐵劑Id誘導的HPBMC細胞凋亡。因此(表1)，本研究在體外驗證了抗氧化劑維C能減輕靜脈鐵劑Id誘導的MHD患者HPBMC的ROS生成和細胞凋亡。

綜上所述，本研究證實靜脈鐵劑能加劇體外培養的MHD患者HPBMC細胞的氧化應激狀態，并誘導細胞凋亡，維生素C對此的干預作用也與臨床報道相符。這可能是靜脈鐵劑誘導MHD患者氧化應激，促進微炎癥狀態，感染等并發癥的發生發展的內在機制之一。

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