E-cadherin、Snail、Twist在胃癌組織及淋巴結轉移灶中的表達及臨床意義

劉利敏，李繼坤

(上海交通大學附屬第一人民醫院 普外科，上海，200080)

胃癌是目前中國第4位常見惡性腫瘤，新確診的惡性腫瘤病例中8%為胃惡性腫瘤[1]。上皮間質轉化(EMT)參與胚胎發育、組織重建和腫瘤轉移，本研究通過檢測胃癌原發灶和淋巴結轉移灶中參與EMT的有關蛋白E-cadherin、Snail及Twist的表達，分析及其與臨床病理特征、預后情況等的相關性，探討EMT與淋巴結轉移之間的關系及其在胃癌侵襲和轉移中的作用和臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2005年12月—2010年7月在上海市第一人民醫院普外科行標準胃癌根治術(D2)的80例患者為研究對象。其中男62例，女18例；確診時年齡45～83歲，中位年齡63歲；Lauren分型：腸型48例，彌漫型32例。所有患者術前各項檢查及術中未發現遠處轉移，術前未行新輔助放、化療。

1.2 方法

1.2.1 標本收集：選取胃癌原發癌灶組織、癌旁正常胃黏膜組織(距腫瘤切緣5cm以上)、胃癌轉移淋巴結及正常淋巴結。

1.2.2 檢測方法：所有標本經4%甲醛固定，石蠟包埋，3 μm切片，常規脫蠟及水化，進行免疫組化染色，方法選用EnVision法。之后的操作按SP試劑盒說明書進行，DAB顯色，一抗(鼠抗人單克隆抗體E-cadherin(M0536)、山羊抗人Snail(ab53519)多克隆抗體、兔抗人Twist(ab50581)多克隆抗體皆購自英國Abcam公司)工作濃度為：E-cadherin(1∶100)，Snail(1∶200)，Twist(1∶200)。PBS代替一抗作為空白對照；以已知陽性切片作為陽性對照。

1.3 觀察指標

觀察患者胃癌術后生存情況；觀察E-cadherin、Snail和Twist蛋白在胃癌組織、淋巴結轉移灶及癌旁正常黏膜組織中的表達情況；分析胃癌組織及淋巴結轉移癌組織中E-cadherin、Snail、Twist蛋白表達與臨床病理學特征的關系。

1.4 評價標準

用雙盲法對染色結果進行評估。E-cadherin表達于胞膜或胞質，呈黃色染色為陽性細胞，Twist蛋白表達于細胞質，少數位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色為陽性細胞。每例切片隨機選取10個高倍視野，以陽性細胞的百分比進行結果判定。E-cadherin：陽性細胞百分比≥25%為陽性；Twist：陽性細胞百分比≥5%為陽性。

Snail染色以胞核或/和胞漿出現淡黃色至棕黃色為陽性細胞。細胞按染色強度結合陽性細胞數百分比綜合計分作半定量分析。染色強度以多數細胞呈現的染色特性計分，與背景著色相對比，0分：無染色；1分：弱陽性；2分：陽性；3分：強陽性。按著色細胞百分比，1分：1%～25%；2分：26%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%。然后按陽性細胞×染色強弱計積分，積分1～2為陰性，積分3～12為陽性。

2 結 果

2.1 E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表達

E-cadherin表達主要位于胞膜或胞漿內，在癌旁正常胃黏膜組織中陽性表達率為100%(80/80)，原發灶中為37.50%(30/80)，淋巴結轉移組織中為63.75%(51/80)；Snail主要在細胞胞漿內或胞核表達，在正常胃黏膜組織內陽性表達率為30.00%(24/80)，胃癌組織中為71.25%(57/80)，淋巴結轉移灶中為53.75%(43/80)；Twist蛋白表達于細胞質，少數位于胞核，呈清晰的棕色或棕褐色，在正常胃黏膜組織中陽性表達率為10.00%(8/80)，胃癌組織中為73.75%(59/80)，淋巴結轉移灶中為68.75%(55/80)。

胃癌原發灶與癌旁正常胃黏膜組織中三種蛋白的陽性表達率均有顯著差異(P<0.01)；胃癌原發灶及淋巴結轉移灶中E-cadherin蛋白和Snail蛋白表達差異有統計學意義(P<0.05)，而Twist蛋白的表達無顯著差異(P>0.05)。

2.2 胃癌原發灶中E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表達與臨床病理學指標的關系

胃癌原發灶中E-cadherin的表達下調、Snail的過度表達與組織學類型、浸潤深度、淋巴結轉移及pTNM分期有關(P<0.05)，Twist過度表達與組織學類型、浸潤深度無關(P>0.05)，三種蛋白的表達均與性別、年齡、腫瘤部位無關(P>0.05)，見表1。

2.3 E-cadherin、Snail、Twist蛋白的表達對胃癌術后生存情況的影響

E-cadherin表達的患者預后顯著好于不表達的患者(圖1)，而Snail、Twist陽性表達的患者與陰性患者相比，預后較差、生存率較低(圖2、圖3)。

總體生存率的多因素分析顯示，E-cadherin的表達情況、組織學分類、有無淋巴結轉移為影響胃癌患者預后的獨立因素(P=0.018，P=0.012，P=0.025)，見表2。

表1 胃癌組織中E-cadherin、Snail、Twist蛋白表達與臨床病理學特征的關系[n(%)]

表2 總體生存率的多因素分析

圖1 E-cadherin陽性/陰性患者生存曲線

圖2 Snail陽性/陰性患者生存曲線

圖3 Twist陽性/陰性患者生存曲線

3 討 論

近年來，隨著診斷技術的提高和內鏡的推廣，胃癌的早期診斷率逐步提高，但標準胃癌根治手術(D2)仍然是目前唯一有望治愈胃癌的方法。研究表明，淋巴結轉移情況是影響胃癌患者預后的最重要的因素之一[2]，即使是早期胃癌，如果伴有淋巴結轉移，與無淋巴結轉移患者相比更容易復發，預后更差[3]。但是目前作者對淋巴結轉移灶在腫瘤侵襲轉移過程中的作用機制還不明確。

上皮間質轉換(EMT)是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質細胞轉分化的現象，其參與胚胎發育、組織重建和腫瘤轉移，上皮細胞表型的缺失及間質特性的獲得是其主要特征。E-cadherin蛋白是上皮表型的重要標志，E-cadherin蛋白功能喪失被認為是EMT發生的一個重要標志，多種腫瘤的侵襲轉移均與E-cadherin表達減弱有關[4]。

研究顯示[5]，在胃癌原發灶組織及淋巴結轉移癌組織中E-cadherin蛋白的表達較正常胃黏膜組織中明顯降低。另有學者發現胰腺癌中EMT相關蛋白E-cadherin的低表達可能會促進淋巴結轉移[6-7]。E-cadherin蛋白的表達與腫瘤浸潤深度呈負相關，存在浸潤越深，病理分期越晚，E-cadherin蛋白陽性表達則相應下降，提示在胃癌發生發展過程中出現了上皮細胞表型的缺失，且這種缺失與腫瘤的侵襲能力相一致。此外，研究結果顯示伴有淋巴結轉移的患者，E-cadherin蛋白的表達明顯減少，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明E-cadherin的缺失對于胃癌的浸潤和轉移具有重要意義。多因素分析也表明E-cadherin的表達情況、組織學分類、有無淋巴結轉移為影響胃癌患者預后的獨立因素(P=0.018，P=0.012，P=0.025)，與本研究結果一致。

Snail、Twist均為EMT發生過程的轉錄調節因子。有研究表明在胃癌原發灶與淋巴結轉移灶中Snail、Twist蛋白的轉換較為頻繁，這可能是因為由EMT產生的腫瘤細胞在淋巴結轉移灶中能夠更頻繁的篩選出具侵襲性的細胞群[8]，提示可能根據這幾種蛋白的表達情況，來判斷胃癌原發灶的侵襲性和轉移性。Shin等[9-10]發現胃癌患者EMT相關蛋白Snail的過度表達與淋巴結轉移密切相關，并提示預后不良。Markiewicz等[11-13]在乳腺癌中以EMT相關標志物判斷腫瘤原發灶的侵襲性，發現E-cadherin、Snail、Twist蛋白與淋巴結轉移密切相關。另有研究[14-16]發現彌漫型胃癌Snail與E-cadherin蛋白下調及腫瘤的遠處轉移相關，表達陽性提示患者的預后不良。本研究發現Snail蛋白在胃癌原發灶與淋巴結轉移灶中的表達水平有顯著差異(P<0.05)，且Snail、Twist蛋白陽性表達的患者較陰性表達患者，其預后相對較差，但多因素分析結果提示Snail、Twist蛋白均不是影響胃癌患者預后的獨立因素。

綜上所述，E-cadherin蛋白的表達情況、組織學分類、有無淋巴結轉移為影響胃癌患者預后的獨立因素，E-cadherin蛋白表達的患者較不表達的患者表現出更好的預后。

[1] Jemal A，Bray F，Center M M，et al. Global cancer statistics[J]. CA: a cancer journal for clinicians，2011，61(2): 69.

[2] Zhang B，Yuan J，Cui Z，et al. Evaluation of the prognostic value of the metastatic lymph node ratio for gastric cancer[J]. The American Journal of Surgery，2014，207(4): 555.

[3] Zheng Z，Liu Y，Bu Z，et al. Prognostic role of lymph node metastasis in early gastric cancer[J]. Chinese Journal of Cancer Research，2014，26(2): 192.

[4] 劉江惠，姜忠彩，郭建文，等. 胃癌中E-cadherin，MMP-2的表達及侵襲轉移機制[J]. 臨床與實驗病理學雜志，2011，27(3): 243.

[5] Joo Y E，Rew J S，Choi S K，et al. Expression of E-cadherin and catenins in early gastric cancer[J]. Journal of clinical gastroenterology，2002，35(1): 35.

[6] Guo S，Xu J J，Xue R，et al. Overexpression of AIB1 correlates inversely with E-cadherin expression in pancreatic adenocarcinoma and may promote lymph node metastasis[J]. International journal of clinical oncology，2014，19(2): 319.

[7] 田蕾，李舒. 生長抑素類似物奧曲肽對人胃癌p53和Ras蛋白表達的影響[J]. 南方醫科大學學報，2011，31(7): 1245.

[8] Ding L，Ellis M J，Li S，et al. Genome remodelling in a basal-like breast cancer metastasis and xenograft[J]. Nature，2010，464(7291): 999.

[9] Shin N R，Jeong E H，Choi C I，et al. Overexpression of Snail is associated with lymph node metastasis and poor prognosis in patients with gastric cancer[J]. BMC cancer，2012，12(1): 521.

[10] 粱秀菊，高明，周云. 胃癌組織EGFR、HER-2與TopoⅡ α的表達及臨床意義[J]. 第三軍醫大學學報，2010，32(22): 2443.

[11] Markiewicz A，Ahrends T，Wenicka-Ja kiewicz M，et al. Expression of epithelial to mesenchymal transition-related markers in lymph node metastases as a surrogate for primary tumor metastatic potential in breast cancer[J]. J Transl Med，2012，10(226): 11.

[12] 李強，黃宗海，厲周，等. 重組腺病毒介導的KDR-CDglyTK基因靶向殺傷胃癌細胞的體外實驗研究[J]. 南方醫科大學學報，2010，30(1): 14.

[13] 李勇，范立僑，趙群，等. 針對survivin的反義寡核苷酸對人胃癌細胞株BGC-823生長、侵襲、遷移能力的影響[J]. 第三軍醫大學學報，2011，33(13): 1350.

[14] Uchikado Y，Natsugoe S，Okumura H，et al. Slug Expression in the E-cadherin preserved tumors is related to prognosis in patients with esophageal squamous cell carcinoma[J]. Clinical cancer research，2005，11(3): 1174.

[15] 黃鎮，王子衛，張能，等. KLF4對胃癌SGC-7901細胞株體外生長增殖的影響[J]. 第三軍醫大學學報，2011，33(8): 822.

[16] 歐陽舉，杜先鳳. 多西紫杉醇聯合卡培他濱及亞葉酸鈣治療晚期胃癌87例臨床分析[J]. 海南醫學院學報，2011，17(11): 1500.