厚樸提取物厚樸酚與氟化物聯合防齲的效果研究

王德堂，何 紅，盧志剛

(荊楚理工學院 醫學院，湖北 荊門 448000)

厚樸提取物厚樸酚與氟化物聯合防齲的效果研究

王德堂，何 紅，盧志剛

(荊楚理工學院 醫學院，湖北 荊門 448000)

目的：通過建立動物模型研究厚樸提取物厚樸酚與氟化物聯合預防齲病的效果，為研究新型防齲藥物提供理論和試驗依據。方法選用無特定病原體的SD大鼠接種國際標準株的變形鏈球菌，喂飼以Keyes研制的2000#致齲食物，分別用無菌蒸餾水、厚樸酚溶液、氟化鈉溶液、氯己定溶液、厚樸酚與氟化鈉混合液連續35 d給大鼠口腔局部涂藥，采用Keyes齲病評分法及培養大鼠口腔內變形鏈球菌水平來評價不同處理方法對變形鏈球菌生長繁殖的影響并評估不同藥物對大鼠齲病抑制的效果。結果抑制變形鏈球菌水平：氟化鈉加厚樸酚組抑制致齲菌明顯優于蒸餾水、氟化鈉、厚樸酚、氯己定組(P<0.05)；氟化鈉、厚樸酚及氯己定三組之間抑菌差異不顯著(P>0.05), 氟化鈉、厚樸酚及氯己定組抑菌優于蒸餾水組(P<0.05)；Keyes記分：光滑面和窩溝面E、Ds及Dm級齲損記分蒸餾水組與氟化鈉、厚樸酚、氯己定及氟化鈉加厚樸酚組都有顯著差異(P<0.05)；光滑面Ds級記分，厚樸酚加氟化鈉組記分為“0”，與厚樸酚、氟化鈉和氯己定組有差別但不顯著(P>0.05)；窩溝面Ds及Dm級齲損記分中，厚樸酚加氟化鈉組與蒸餾水、厚樸酚、氟化鈉和氯己定組有顯著差異性(P<0.05)，厚樸酚、氟化鈉和氯己定三組之間有差異但不顯著。結論厚樸酚、氟化鈉和氯己定單獨使用均有較好的防齲作用，而厚樸酚與氟化物聯合制劑聯合防齲效果更佳，可明顯減少大鼠齲病的形成及減輕齲損破壞程度，厚樸酚與氟化物聯合防齲有一定的研究和應用價值。

厚樸酚；齲??；變形鏈球菌；Keyes齲病評分法

齲病是口腔常見病和多發病，WHO把它列為繼心血管疾病和癌癥之后的第三大重點防治疾病。含氟制劑是目前齲病預防常用的方法，能有效抑制致齲菌，促進牙齒再礦化，但氟制劑具有明顯的局限性，如氟濃度的穩定性、過多或不當的使用引起氟中毒、不同地域之間環境含氟量不同造成氟制劑的有效濃度和安全劑量很難確定等。為此，國內外很多學者轉向天然防齲藥物的研究。

厚樸酚是厚樸的活性成分，現已證實能有效的抑制或殺死致齲菌，抑制效果與氟化物相當。與氟化物相比的優點是安全劑量大，副作用小，有研究證實不會引起腸道菌群失調，但其缺點是促進牙齒再礦化作用不明顯，因此單獨使用防齲效果也有限[1-2]。

本研究通過建立齲齒動物模型，將厚樸酚與氟化物聯合應用，采用Keyes齲病評分等方法研究其防齲療效，進而為齲病的防治尋找一種安全、有效和經濟的藥物。

1 材料和方法

1.1 儀器

體視顯微鏡；超薄型金剛砂片；電熱恒溫箱；厭氧培養箱；光學顯微鏡；壓力蒸汽滅菌器。

1.2 試劑

厚樸酚(純度>99%，南京廣潤生物制品有限公司)；氨芐西林膠囊(珠海聯邦制藥股份有限公司中山分公司)；氟化鈉(純度>99%，江西世龍實業化工股份有限公司)；氯己定(西安天正藥用輔料有限公司)；采用變形鏈球菌亞群表兄鏈球菌6715(S.sobrinus6715)國際標準株(武漢大學口腔醫學院口腔生物醫學工程教育部重點實驗室提供)；BHI血瓊脂和MSB瓊脂培養基[3]。

1.3 動物和飼料

無特定病原體SD大鼠(SPF-SD)100只，雌雄各半，由貴陽醫學院實驗動物中心提供，致齲食譜采用Keyes為小鼠和倉鼠致齲所配制的2000#食譜[2]。

2實驗方法

2.1 藥液配制

采用30%聚乙二醇400將厚樸酚配制成1 mg/mL的母液，濾過器過濾消毒將母液稀釋到6.3 μg/mL；用蒸餾水將高純度的氟化鈉稀釋成含氟化鈉0.1 mg/mL溶液和含1.2 mg/mL(0.12%)氯己定溶液；將濃度為6.3 μg/mL的厚樸酚與0.1 mg/mL氟化鈉溶液按1∶1的容積比配成復合制劑置于4 ℃的冰箱備用。

2.2 實驗分組

本實驗分為5組，分別為蒸餾水組(空白對照組)，厚樸酚與氟化鈉混合組(實驗組)，厚樸酚、氟化鈉、氯己定組(陽性對照組)，每組20只SPF-SD大鼠。

2.3 齲病動物模型的建立[4]

選取18 d齡大的SPF-SD大鼠100只(雌雄各半)，均無齲齒。給予致齲飼料2000#喂養2 d，鼠齡20～22 d在飲水和普通飼料中分別加入氨芐西林(濃度分別為400 U/mL和4 mg/g)，23 d齡大鼠取口腔唾液觀察抗生素抑菌效果，目的是為了殺滅大鼠口腔內原有的細菌后，進行S.sobrinus國際標準株的接種。

鼠齡24～28 d恢復給予致齲飼料2000#并持續至實驗結束，并在大鼠牙面連續接種新鮮培養18 h的S.sobrinus6715，濃度為2×109菌落形成單位(CFU)/mL，每只鼠口腔用無菌棉簽涂拭菌液200 μL，涂拭后2 h內禁食禁飲，間隔30 min后再接種1次。細菌接種前后(即鼠齡23 d和29 d)用無菌棉簽隨機采集20只大鼠口腔內牙菌斑樣本，經稀釋涂平板，37 ℃厭氧培養，檢測細菌是否接種成功。鼠齡29 d對大鼠隨機分組編號，64 d再次隨機取20只大鼠牙菌斑，稀釋后置于BHI血瓊脂(記錄總菌落數)和MSB瓊脂(記錄S.sobrinus菌落數)培養，求兩者比值即S.sobrinus水平[5]。

自30 d開始用無菌棉簽蘸取無菌蒸餾水、厚樸酚溶液、氟化鈉溶液、氯己定溶液、厚樸酚與氟化鈉混合液涂抹各實驗組大鼠口腔黏膜及牙齒的各個面，為確保藥液到位，每只大鼠用鈍頭注射器抽取1 mL藥液注射于口腔保持10 s漱口，處理后2 h內禁食禁飲。

2.4 Keyes法對齲損分級評分

65 d后乙醚窒息處死大鼠，斷顱，分離上下頜骨，去除軟組織后將頜骨浸入2%氫氧化銨溶液中浸泡30 min，清洗干燥后置于0.4%的紫脲酸銨染液12 h后清水沖洗，室溫自然干燥，用薄金鋼砂片沿上、下頜磨牙近遠中向矢狀片切，清洗干燥后根據Keyes經典評分標準在體視顯微鏡下分別對每只鼠磨牙的光滑面和窩溝處牙釉質齲(E)、牙本質淺齲(Ds)、牙本質中齲(Dm)、牙本質深齲(Dx)進行評分，以此評定藥物抑制齲病的情況。

2.5 統計處理

采用SPSS16.0統計軟件包，對計量資料采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 S.sobrinus定植情況

在接種S.sobrinus前(即鼠齡23 d前)采集大鼠口腔內牙菌斑經MSB瓊脂培養基培養后未見變形鏈球菌菌落，革蘭染色和生化鑒定也未檢出變形鏈球菌；接種S.sobrinus 3 d后(即鼠齡29 d)采集大鼠口腔內牙菌斑培養見培養基內大量S.sobrinus菌落，經革蘭染色和生化鑒定為S.sobrinus，定植成功。64 d S.sobrinus水平變化見表1，實驗組與陽性對照組和空白對照組之間相比有顯著差異(P<0.05)，氟化鈉、厚樸酚及氯己定組差異不顯著(P>0.05)，氟化鈉、厚樸酚及氯己定組與蒸餾水組有顯著差異(P<0.05)。S.sobrinus水平的計算式為：

S.sobrinus水平[5]=(S.sobrinus菌落數/總菌落數)×100%

表1 鼠齡64 d大鼠牙菌斑中菌落數及S.sobrinus比值

3.2 大鼠齲損Keyes記分[5]

3.2.1 光滑面Keyes記分

具體記分結果見表2，在E級齲損記分中，除蒸餾水組與各組之間相比有明顯的統計學意義(P<0.05)外，其余各組之間Keyes記分無統計學意義(P>0.05)；在Ds級記分中，厚樸酚加氟化鈉混合液未檢出，與蒸餾水組相比有統計學意義(P<0.05)，厚樸酚、氟化鈉和氯己定組與蒸餾水組相比Keyes記分有所降低，但無統計學差異(P>0.05)，Dm和Dx級齲損僅蒸餾水組檢出。

表2 光滑面齲損Keyes記分

3.2.2 窩溝齲損Keyes記分

外觀觀察各組磨牙交合面均有不同程度齲壞，具體記分結果見表3。E級齲損記分：蒸餾水組與其余各組相比有顯著差異(P<0.05)； Ds及Dm級齲損記分中，厚樸酚加氟化鈉組與蒸餾水、厚樸酚、氟化鈉和氯己定組有顯著差異(P<0.05)，厚樸酚、氟化鈉和氯己定三組之間有差異但不顯著(P>0.05)；在Ds級記分中，厚樸酚、氟化鈉和氯己定組與蒸餾水組也有顯著差異(P<0.05)；Dm級記分中，蒸餾水組與各組有顯著差異(P<0.05)，陽性組之間無明顯差異；Dx級齲損記分：厚樸酚加氟化鈉組未檢出，厚樸酚、氟化鈉和氯己定三組與蒸餾水組比較有統計學差異(P<0.05)。

表3 窩溝面齲損記分

4 討論

齲病是一種以細菌為主的多因素作用下的，牙體硬組織發生慢性進行性破壞的感染性疾病，2005年我國第三次口腔健康流行病學抽樣調查結果顯示5歲兒童乳牙患齲率為66%，12歲兒童恒牙患齲率為28.9%，35～44歲年齡組患齲率為88.1%，65～74歲患齲率為98.4%，齲病患病率之高，嚴重危害了人類口腔及全身健康[6]。目前，齲病的預防措施主要有口腔衛生保健、飲食控制、氟化物的應用、抗微生物藥物和免疫防齲等綜合途徑。發現氟化物可以防齲是20世紀預防口腔醫學對人類最大貢獻之一，世界衛生組織(WHO)、世界牙科聯盟(FDI)、國際牙科研究學會(IADR)在 2006年11月聯合召開的“使用氟化物促進口腔健康全球專家大會”上，進一步強調使用氟化物來預防齲病是目前降低人群患齲率切實可行的方法。氟化物防齲的有效性已得到公認并被廣泛接受，但這并不意味氟化物防齲就是理想方法，氟化物的使用也具有明顯的局限性，例如氟濃度的穩定性難以維持、過多或不當的使用可引起急慢性氟中毒、不同地域之間環境含氟量不同造成氟制劑的有效濃度和安全劑量很難確定，人造氟斑牙、氟骨癥難以避免等，20世紀七、八十年代廣州飲用水加氟引起氟斑牙流行就是一次慘痛的教訓。此外，含氟化產品的使用需要眾多專業人士指導和實施，耗資巨大，同我國國情極不相符，更不適合我國齲病的群體性防治?？刮⑸镏苿┤缢沫h素、洗必泰雖然有較好的防齲效果，但由于它是一種廣譜抗菌劑，長期使用易引起口腔菌群失調，使細菌產生耐藥性，因此，應用抗生素防齲也受到極大的限制。免疫防齲面臨著增強免疫原性以及人體應用的安全性問題，同時對口腔菌群生態影響的問題仍有待解決。因此，尋找安全、有效、經濟的防齲藥物是目前齲病防治研究的重點，于是廣泛生存在自然界的天然藥物進入口腔預防醫學研究者的視野，目前厚樸提取物厚樸酚防齲成為了國內外研究的熱點和重點。

早在80年代，日本學者Namba[7]等在對厚樸等180種生藥進行篩選研究中發現，厚樸的提取物對變形鏈球菌有很強的抗菌作用，并對厚樸的主要化學成分厚樸酚及厚樸酚作藥敏實驗，測定其最低抑菌濃度(MIC)為6.3 μg/mL，而且2.5 min即可達到殺菌效果。四川大學馮謹[1]博士發現厚樸酚對變鏈菌的作用受蔗糖影響，而對變鏈菌的GTF酶活性并無抑制作用，認為厚樸酚的抗菌作用只是單純的抑菌或殺菌。同期國內學者也證實了厚樸酚對致齲菌的抑殺作用，烏愛菊[2]等對不同厚樸提取物抑菌作用比較時發現，厚樸酚對變鏈菌的MIC為10 μg/mL，但對大腸桿菌抑制濃度在10 mg/mL以上，因此認為長期口服含厚樸酚的制劑對腸道正常菌群來說是安全的，提示厚樸酚作為抗齲藥物具有良好的應用前景。近年來，國內外學者對厚樸酚抗齲的研究更深入到細菌致齲的毒力因子。李君等[8]研究厚樸酚對于溶液中及唾液包被的輕磷灰石(sHA)表面的變鏈菌GTF(葡萄糖基轉移酶)酶活性的影響時發現，厚樸酚在濃度為1.25～5 mg/mL時能有效抑制溶液中以及吸附到sHA表面的GTF酶活性。黃冰冰等[9]研究發現厚樸酚能顯著抑制GTF酶、a淀粉酶和a葡糖昔酶的活性，降低變鏈菌蔗糖依賴性及蔗糖非依賴性粘附，證明厚樸酚對GTF-I的抑制作用位點在GTF-I葡聚糖結合區，認為厚樸酚具有多方面的抗齲效果。同時馮謹[1]還首次實驗證實厚樸的防齲有效成分對牙齒礦化沒有明顯的作用，而齲病的形成機制是致齲菌在代謝過程中產酸，導致局部牙體硬組織脫礦，輕磷灰石晶體溶解破壞，無機鈣、磷移出所致。由于其促進牙齒再礦化作用不明顯，因此單獨使用防齲效果也有限。

介于氟化物與厚樸提取物單獨使用防齲各自有其優缺點，本研究意在探索能否將兩者配制成復方制劑，相互取長補短，研制出一種新型、安全、經濟、有效及適合所有人群使用的防齲產品。從本次研究的結果發現，在動物模型中鼠齡64 d時采集大鼠牙菌斑進行細菌培養后進行S.sobrinus菌落計數和S.sobrinus水平分析發現，在抑制S.sobrinus方面，厚樸酚加氟化鈉組明顯優于其他組，顯示出具有協同效應的效果；同時氟化鈉、厚樸酚、氯己定組與蒸餾水組比較，也顯示出氟化鈉、厚樸酚、氯己定單獨使用有其較強的抑制致齲菌的能力，且三者之間差異不顯著，實驗驗證厚樸酚與氟化鈉聯合使用比單獨使用在抑制致齲菌方面效果更好。

大鼠磨光滑面和窩溝齲損Keyes記分分析，Keyes評分法直觀、客觀，能準確反應齲損的破壞程度，具有實際應用價值。光滑面Keyes記分方面，E級齲損蒸餾水組與其余各組有統計學差異，其余各組之間以厚樸酚與氟化鈉組記分最低，但無統計學差異。Ds級記分厚樸酚加氟化鈉制劑組為“0”；窩溝齲分級Keyes記分中，厚樸酚加氟化鈉僅在E和Ds級檢出，Dm和Dx級都未檢出且與各組間有統計學意義，實驗說明，厚樸酚與氟化鈉聯合應用防齲能力有所提高。

關于陽性對照組藥物及藥物濃度選擇的理論基礎、實際應用價值和科學性的說明。氟化物防齲效果是目前已公認的，其抗齲機制是抑制致齲菌代謝生長、減少牙菌斑內酸的形成、降低牙釉質溶解度及促進牙釉質再礦化，但對細菌的作用需要依賴藥物濃度，濃度過低不起作用，過高又容易引起氟中毒，為此國內外的很多學者對氟化物的藥用濃度進行了研究，公認的對致齲菌作用的濃度是在10 μg/mL時抑制細菌代謝，在0.1～0.25 mg/mL可以抑制細菌生長，當濃度達到1 mg/mL時可以殺死細菌[10]；氯己定系二價陽離子表面活性劑，是目前已知殺菌能力最強、最有效的化學抑制菌斑劑，對革蘭氏陽性和陰性及真菌都有殺菌作用，故藥效學研究中常用它來作為陽性對照和金標準來評價其他抗菌藥，目前臨床上常用0.12%～0.2%濃度的溶液預防和治療口腔疾??；厚樸酚在前文已述；本研究藥物濃度均選擇MIC，主要是為避免由于藥物濃度過高，使實驗結果失真。

本研究初步證實了厚樸提取物厚樸酚與氟化物聯合防齲可提高預防齲病的效果，其所期待解決的問題及不足，一是該研究雖然顯示厚樸酚與氟化鈉聯合防齲效果優于單獨使用，但其產生的效應是否系二者具有協同效應還有待于進一步研究證實；二是動物模型畢竟不同于人，人的口腔環境及人體免疫機能都與大鼠有很大差異，將該研究方法在人體進行實驗是否具有相同的結果還需要進一步設計驗證。

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[10] 卞金友.口腔預防醫學[M].北京:人民衛生出版社,2011.

2014-07-10

荊楚理工學院校級科研項目(ZR201106)

王德堂(1979-)，男，貴州江口人，荊楚理工學院講師，碩士。研究方向：口腔預防醫學； 何紅(1971-)，女，湖北荊門人，荊楚理工學院副教授，碩士。研究方向：口腔醫學； 盧志剛(1975-)，男，湖北京山人，荊楚理工學院副教授，博士。研究方向：中醫中藥學。

R285.5

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1008-4657(2014)04-0067-05

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