姜黃素誘導惡性黑色素瘤細胞凋亡及對AIFM2基因表達的影響

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(上海交通大學附屬第六人民醫院 整形外科，上海 200233 )

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·實驗研究·

姜黃素誘導惡性黑色素瘤細胞凋亡及對AIFM2基因表達的影響

鄧辰亮，鄭江紅，萬偉東，楊波，茅廣宇，劉斌，楊松林*

(上海交通大學附屬第六人民醫院 整形外科，上海 200233 )

目的 明確姜黃素誘導惡性黑色素瘤細胞系A375凋亡的作用，探討姜黃素作用機制。方法 A375細胞系經5～20 μmol/L姜黃素作用48 h后, MTT法測定細胞增殖能力；流式細胞儀檢測細胞凋亡;RT-PCR方法檢測細胞AIFM2及p53 mRNA的表達。結果 0、5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黃素作用A375細胞48 h后細胞增殖抑制率分別為1.1%±0.3%、14.9%±5.9%、21.6%±4.7%、41.5%±5.4%;凋亡所占的百分比分別為3.5%±1.8%、17.1%±7.8%、23.8%±6.0%、33.6%±4.4%；AIFM2基因mRNA表達相對比值為(0.6±0.2)、(0.8±0.2)、(1.0±0.4)、(1.2±0.5)；p53 mRNA表達相對比值分別為(0.9±0.4)、(1.1±0.4)、(1.2±0.5)、(1.3±0.4)。各組之間均存在統計學意義(P<0.05)。伴隨姜黃素作用濃度的升高,A375細胞的生長被顯著抑制。AIFM2 mRNA與p53 mRNA表達顯著上調。結論 姜黃素可能通過上調AIFM2基因的表達促使黑色素瘤細胞凋亡。

惡性黑色素瘤;姜黃素;AIFM2基因;凋亡

姜黃素(curcumin)是從中藥姜黃根莖提取的二酮類色素[1]。具有抗腫瘤、抗感染等作用[2-6]。且對惡性黑色素瘤細胞有明顯的促凋亡作用[7]。本研究通過觀察姜黃素誘導惡性黑色素瘤A375細胞系凋亡過程中AIFM2基因的變化,探索其作用機制，為治療惡性黑色素瘤提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人惡性黑色素瘤細胞系A375(以下簡稱為A375)購于中科院上海細胞所；姜黃素(使用時用DMEM培養液稀釋至所需濃度)、四氮唑溴鹽(MTT)和AnnexinV/PI雙標試劑盒均購自美國Sigma公司；DMEM培養基(美國Gibco公司)；10%小牛血清(美國Hyclone公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞增殖活力檢測 將104個/mL的A375細胞接種于96孔板，37 ℃、5%CO2培養24 h后，分別使用5.0、10.0、20.0 μmol/L的姜黃素處理，計算細胞增殖抑制率。

1.2.2 細胞凋亡分析 根據Annexin V/PI雙標試劑盒說明,調整細胞濃度為5×105/mL。用流式細胞儀分析。采用Cellquest軟件分析結果。

1.2.3 AIFM2及p53 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法。收集目的A375細胞提取細胞總RNA，取0.5 μg RNA進行反轉錄，以反轉錄合成的cDNA為模板，進行PCR反應。產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，Quantity One系統進行灰度分析。

1.2.4 統計學方法 應用SPSS 19.0軟件統計分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 姜黃素對A375細胞增殖活力影響 5.0 μmol/L姜黃素對A375細胞增殖抑制率為14.9%±5.9%，10.0 μmol/L抑制率為21.6%±4.7%，20.0 μmol/L抑制率為41.5%±5.4%，對照組抑制率為1.1%±0.3%。各組之間均存在統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 姜黃素對A375細胞增殖抑制統計分析

2.2 Annex in V/PI檢測細胞凋亡 5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黃素分別作用A375細胞48 h后，凋亡所占的百分比分別為，17.1%±7.8%，23.8%±6.0%，33.6%±4.4%，對照組為3.5%±1.8%。各組之間均存在統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 姜黃素影響A375細胞凋亡率的統計分析

2.3 姜黃素對A375細胞AIFM2和p53 mRNA 轉錄水平影響 0、5.0、10.0、20.0 μmol/L姜黃素作用A375細胞48 h后AIFM2 mRNA表達相對值分別為(0.6±0.2)、(0.8±0.2)、(1.0±0.4)、(1.2±0.5)；p53 mRNA表達相對值分別為(0.9±0.4)、(1.1±0.4)、(1.2±0.5)、(1.3±0.4)。各組比較有統計學意義(P<0.05)。見圖3～圖4。

圖3 p53 mRNA和AIFM2 mRNA表達電泳結果

圖4 p53 mRNA和AIFM2 mRNA表達統計結果

3 討論

惡性黑色素瘤的惡性程度極高，常隱匿發生，且對放化療不敏感，治療難度大。姜黃素既能促進腫瘤細胞凋亡又能抑制腫瘤細胞轉移[2,4-5]。國內外研究者[6-7]也就姜黃素誘導腫瘤細胞凋亡進行了大量的研究。然而，其機制仍不清楚。

AIFM2(apoptosis-inducing factor,mitochondrion-associated，2)作為凋亡誘導因子基因，編碼黃素蛋白氧化還原酶，使其與DNA單鏈發生于與序列無關的結合,促進細胞凋亡。在多數人體腫瘤組織中AIFM2基因表達下調[8]。本研究中，筆者發現，未誘導組中A375細胞AIFM2基因的表達相對較低，經過姜黃素誘導48 h后，A375細胞AIFM2基因表達明顯上調，細胞凋亡率也明顯增加。重要的是AIFM2基因促進腫瘤細胞凋亡不依賴于caspase所介導的細胞經典凋亡途徑[9]。因此，本研究提示，姜黃素可能能通過多途徑誘導A375細胞凋亡。

P53基因是人類發現的與腫瘤高度相關性的基因之一。野生型P53基因是一種抑癌基因，而導致腫瘤發生的P53基因則為突變型。在多數腫瘤中發現的高表達P53蛋白也是P53基因突變的產物。本研究中，經過姜黃素誘導后黑色素瘤細胞，筆者發現AIFM2基因上調的同時p53基因表達也上調。而另據報道AIFM2基因在結腸癌細胞中被p53/TP53誘導4 h后可發生明顯的表達上調。因此，AIFM2基因表達的改變究竟來源于姜黃素直接作用，還是通過p53基因上調后的間接作用，還有待今后的實驗研究。筆者在研究中發現,姜黃素作用后A375細胞AIFM2 mRNA表達明顯升高，而且AIFM2 mRNA表達與姜黃素濃度呈明顯的量效依賴關系。由于AIFM2分子所介導的線粒體性細胞凋亡不依賴caspase分子[9]。因此，姜黃素不僅可以通過活化caspase分子促進腫瘤細胞凋亡，也可以通過不依賴caspase分子的線粒體性途徑凋亡。這一發現在國內外尚未見報道。綜上所述，姜黃素作為一種具有潛在應用價值的預防與治療腫瘤的藥物，通過抑制腫瘤細胞增殖，以及加強AIFM2與p53基因的表達加速黑色素細胞凋亡，為治療惡性黑色素瘤提供了另一條可能的途徑。

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AIFM2geneexpressionandapoptosisinducedbycurcumininhumanmalignantmelanomacellline

DENG Chenliang,ZHENG Jianghong,WAN Weidong,YANG Bo,MAO Guangyu,LIU Bin,YANG Songlin*

(Department of Plastic Surgery,The 6th People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University,Shanghai 200233,China)

ObjectiveTo explore the mechanism and effect of curcumin on human malignant melanoma cell line A375 apoptosis.MethodsA375 cell line were treated by 5～20 μmol/L curcumin.Cell proliferation was measured by MTT.Apoptosis was detected by flow cytometry.RT PCR was used to detect AIFM2 and p53 mRNA expression.ResultsThe cellular proliferation inhibition rates of 0,5.0,10.0,20.0 μmol/L curcumin on A375 cell were 1.1%±0.3%、14.9%±5.9%、21.6%±4.7%、41.5%±5.4% after 48 hours.The percentages of apoptosis were 3.5%±1.8%、17.1%±7.8%、23.8%±6.0%、33.6%±4.4%.The relative ratios of AIFM2 gene mRNA were (0.6±0.2)、(0.8±0.2)、(1.0±0.4)、(1.2±0.5).The relative ratios of p53 mRNA expression were (0.9±0.4)、(1.1±0.4)、(1.2±0.5)、(1.3±0.4).There are significant differences among these groups (P<0.05).The growth of A375 cell was significantly inhibited with the increase of the concentration of curcumin.AIFM2 mRNA and p53 mRNA expressions were significantly increased.conclusionsCurcumin can increase AIFM2 gene expression to accelerate the apoptosis of melanoma cells.

malignant melanoma;curcumin;AIFM2;apoptosis

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.01.004

國家自然科學基金(81000837)。

鄧辰亮(1976-)，男，博士，主治醫師。研究方向：黑色素瘤治療。

] 楊松林，電子信箱slyang@sjtu.edu.cn。

R285.5

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2095-6258(2014)01-0009-03

2013-09-26)

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