超微四神丸對泄瀉模型大鼠T細胞亞群的影響

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(1.湖南中醫藥大學，長沙 410208；2.湖南中醫藥大學 省部共建中醫內科學教育部重點實驗室，長沙 410007)

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超微四神丸對泄瀉模型大鼠T細胞亞群的影響

蔡瑩1，藺曉源2，鄧娜1

(1.湖南中醫藥大學，長沙 410208；2.湖南中醫藥大學 省部共建中醫內科學教育部重點實驗室，長沙 410007)

目的 觀察超微四神丸對泄瀉模型大鼠T細胞亞群的影響，探討超微四神丸治療泄瀉的免疫學機制。方法 將40只SD大鼠隨機分組，按參考文獻[2]制備脾腎陽虛泄瀉模型，各組給予不同處理后，采用流式細胞儀檢測外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+的變化情況。結果 模型組外周血CD3+、CD4+細胞百分比降低,與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，CD8+細胞百分比較正常組升高(P<0.05),CD4+/CD8+比值明顯低于正常組(P<0.05)。四神丸湯劑組和超微組上述指標均有改善,與模型組比較有統計學意義(P<0.05或P<0.01),且超微組在調節CD4+和CD8+水平上優于湯劑組(P<0.05)。結論 超微四神丸對泄瀉大鼠的作用與調節外周血T細胞亞群水平有關。

超微四神丸；泄瀉；T細胞亞群；大鼠

脾和腎為中醫藏象體系中重要的兩臟，“腎為先天之本，脾為后天之本”，且認為兩臟關系密切，但脾腎兩臟是否確實存在相關性，其現代生物學基礎是什么，是值得深入探討的一個課題。目前研究發現，脾虛證、腎虛證都有不同程度的免疫功能低下，免疫功能可能是脾腎相關的一種重要生理機制。脾腎相關的病理證候是脾腎陽虛[1]，而四神丸是治療脾腎陽虛型泄瀉的經典名方，本研究從免疫功能研究超微四神丸對脾腎陽虛模型動物的干預效應，運用流式細胞檢測技術探討超微四神丸對模型大鼠外周血中T細胞亞群的影響,揭示其調節機制和作用靶點，以期為研究脾腎相關提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠40只，雄性，體質量280～300 g，由湖南斯萊克景達實驗動物公司提供，許可證號:SCXK(湘)2009-0004。

1.2 實驗藥物 四神丸(補骨脂、肉豆蔻、五味子、吳茱萸、大棗、生姜)按2005年《中國藥典》標準的藥物配比(4∶2∶2∶1∶2∶2)組方。四神丸水煎劑和超微劑型均由湖南中醫藥研究院超微中心提供,生藥含量0.5 g/mL；200%的大黃濃縮水煎液，置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器 小鼠抗大鼠CD3-FITC(異硫氰酸熒光素)、小鼠抗大鼠CD4-FITC、小鼠抗大鼠CD8b-FITC均由長沙麗欣生物技術有限購公司代購。GL20A高速冷凍離心機(湖南儀器儀表總廠離心機廠)，流式細胞儀(美國貝克曼公司)。

1.4 動物造模 按參考文獻[2]，造模分2個階段完成:第一階段灌服(200%)大黃水煎液2 mL復制脾虛模型;第2階段在脾虛基礎上肌肉注射氫化可的松25 mg/(kg·d)復制腎虛模型。

1.5 分組與給藥 所有動物適應性喂養3 d后，按體質量隨機抽取10只作為正常組，其余開始造模，造模成功后，再隨機分為模型組、四神丸湯劑組和超微四神丸組，每組10只。四神丸湯劑組給予四神丸湯劑灌胃，超微四神丸組給予四神丸超微溶液，模型組給予蒸餾水，灌胃劑量均為臨床等效劑量，連續用藥14 d，正常組常規喂養。

1.6 指標檢測 大鼠末次給藥后用10%水合氯醛(4.0 mL/kg)麻醉，腹主動脈取血2 mL直接置于預冷的試管內，4 ℃離心(3 500 r/min)10 min，取上層血清置-30 ℃冰箱保存待測。流式檢測T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+百分比，并計算CD4+/CD8+比值。

2 結果

各組大鼠外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值變化比較 見表1。

表1 各組大鼠外周血T細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值變化

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與四神丸湯劑組比較，▲P<0.05。

3 討論

脾腎相關理論起源于《黃帝內經》。《素問·五臟生成篇》曰：“腎之合骨也，其榮發也，其主脾也”。在中醫藏象理論中，脾陽根于腎陽，脾的陰陽皆以腎水腎火為根蒂。脾陽賴腎陽溫煦而生化精微，脾土得腎水濡養而健運不息。《素問·宣明五氣篇》曰：“脾為涎”“腎為唾”，而現代研究[3-4]表明，“涎”“唾”為脾腎所共主。脾氣虛證、腎虛證都有不同程度的免疫功能低下及內分泌紊亂。

脾腎陽虛瀉又稱“五更泄”，屬現代醫學非特異性潰瘍性結腸炎、慢性腹瀉的范疇。中醫學認為，五更瀉多因泄瀉日久，導致脾腎陽虛所致。治宜溫腎暖脾為主。四神丸由《普濟本事方》的二神丸與五味子散兩方組合而成，有溫腎暖脾、固腸止瀉之效。

腸道免疫反應的調節有賴于免疫細胞、免疫因子及免疫球蛋白的參與，因此脾腎陽虛泄瀉發病涉及T細胞亞群及炎癥介質的變化。T細胞亞群中CD4+(輔助性T淋巴細胞)具有調節免疫反應的活性，輔助B細胞產生抗體，分泌細胞因子的作用；而CD8+(抑制性T淋巴細胞)則有免疫抑制和細胞毒性作用。CD4+/CD8+比值正常情況下相對穩定,維持機體細胞免疫功能。如果兩者比例失衡可導致機體免疫功能缺陷[4]。研究[5]顯示：肝郁脾虛兼心神不寧型腹瀉型IBS患者存在免疫功能紊亂,表現為外周血CD3+無異常，CD4+明顯低于正常，CD8+則高于正常,CD4+/CD8+比值明顯下降,說明腹瀉型IBS存在外周血T細胞亞群的異常。研究[6]證實，脾氣虛證模型大鼠外周血T淋巴細胞總數(CD3+細胞)減少，T細胞亞群變化見CD4+T細胞降低，CD8+T細胞不變或升高，CD4+/CD8+比值降低,脾臟T細胞增值反應降低。外周血CD4+計數CD4+/CD8+比值降低[7]。李慶陽等[8]分析了老年腎虛患者T淋巴細胞亞群變化，發現CD3+和CD4+顯著下降，CD8+顯著升高。

本研究結果顯示，模型大鼠CD3+、CD4+細胞百分比降低，CD8+細胞百分比升高,CD4+/CD8+比值明顯低于正常組，表明模型大鼠發生了免疫功能的紊亂。四神丸湯劑組和超微組上述指標均較模型組有所改善(P<0.05或P<0.01)，且超微組調節CD4+和CD8+的作用優于湯劑組(P<0.05),表明四神丸可能通過調節T淋巴細胞亞群的變化而到達調節自身免疫功能的目的，其超微劑型療效更為明顯，同時也揭示出通過以方測證研究脾腎相關思路的合理性。

[1]趙慧,榮向路,陳芝喜.脾虛、腎虛證及脾腎相關的客觀化研究[J].中國臨床康復,2006,10(47):130-135.

[2]王立峰,陳芝喜,趙慧,等.強肌健力方對脾腎兩虛證大鼠血漿性激素水平的影響[J].放射免疫學雜志,2008,21(2):147-149.

[3]駱麗娟,黃文宜.脾腎相關的證型實驗研究概況[J].現代生物醫學進展,2006,6(6):49，57.

[4]竇榮華.免疫細胞學與疾病[M].北京:中國醫藥科技出版社,2004:893.

[5]程宏輝,周福生.順激方治療腸易激綜合征30例及對T細胞亞群的影響[J].陜西中醫,2009,30(7):835-836.

[6]樊雅莉.大鼠脾氣虛模型初步規范化的部分細胞免疫功能研究[J].中國中醫基礎醫學雜志,2002,8(10):63-64.

[7]徐州,肖國輝,李志,等.香砂六君顆粒治療脾虛胃病的臨床及實驗研究[J].中華實用中醫學雜志,2005,18(11):1629-1632.

[8]李慶陽,鄭家鏗.老年腎虛與T細胞亞群關系[J].福建中醫學院學報,2001,11(2):5-6.

EffectsofultrafinesishenpillonTlymphocytesubsetinthemodelofdiarrheasyndromerats

CAI Ying1,LIN Xiaoyuan2,DENG Na1

(1.TCM University of Hunan,Changsha 410208,China；2.Key Laboratory of Internal Medicine Traditional Chinese Medicine University of Hunan,Changsha 410007,China)

ObjectiveTo observe the effects ofUltrafineSishenPillon T lymphocyte subset in the model of diarrhea Syndrome rats,and to explore the immunological mechanism ofUltrafineSishenPillon diarrhea.Methods40 SD rats were divided into different groups randomly.Prepare spleen-kidney Yang deficiency of diarrhea model.Each group was giving different treatments,CD3+、CD4+、CD8+of T lymphocyte cell subset were measured by flow cytometer.ResultThe percentage of CD3+、CD4+in peripheral blood of model group was decreased,the difference was significant compared with the normal group(P<0.05 orP<0.01).The percentage of CD8+of model group was increased,compared with the normal group(P<0.05),the ratio of CD4+/CD8+was lower than the normal group(P<0.05).The above-mentioned indexes of Sishen Pill decoction group and Ultrafine group were improved,compared with model group they had a significant difference (P<0.05 orP<0.01),and Ultrafine group in the reduction of CD4+and CD8+was superior to the decoction group.ConclusionEffects of Ultrafine Sishen Pill on diarrhea Syndrome in rats are possibly associated with T Lymphocyte subset.

UltrafineSishenPill;Diarrhea;T Lymphocyte subset;rats

10.13463/j.cnki.cczyy.2014.01.005

湖南省教育廳科研項目資助課題(11C0960)。

蔡 瑩(1982-)，女，博士，講師。研究方向：中醫藥防治消化系統疾病。

R285.5

：A

2095-6258(2014)01-0012-03

2013-09-04)