吲哚胺2，3-雙加氧酶在T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)移植腎組織中的表達(dá)

劉佳 王曉勃 郭濤 劉麗 豐貴文 尚文俊 劉磊 李金鋒

(1.河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校診斷學(xué)教研室，河南鄭州 451191；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎移植科，河南鄭州 450052)

隨著腎移植技術(shù)的提高以及強(qiáng)效免疫抑制藥物的應(yīng)用，腎移植已成為治療終末期腎病最有效的方法。近年來(lái)，移植腎的短期存活率大幅度提高，但遠(yuǎn)期存活率并不理想[1]。腎移植后受體對(duì)移植腎的排斥反應(yīng)影響腎移植患者長(zhǎng)期存活[2-3]。色氨酸在哺乳動(dòng)物體內(nèi)普遍貧乏，而它卻是T細(xì)胞增殖活化過(guò)程中合成蛋白質(zhì)所必需的氨基酸[4]。吲哚胺2，3-雙加氧酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)作為肝臟以外的催化色氨酸沿犬尿氨酸途徑代謝的限速酶，耗竭色氨酸而抑制T細(xì)胞的免疫反應(yīng)[5]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)移植腎組織中IDO的表達(dá)情況，初步探討IDO在T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年4月—2012年10月經(jīng)病理確診為T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)移植腎組織標(biāo)本38例，其中移植腎穿刺標(biāo)本35例，移植腎切除標(biāo)本3例。38例腎移植患者中，男性24例，女性14例；年齡24～52歲，平均年齡(35.2±9.4)歲；25例患者術(shù)后采用他克莫司+嗎替麥考酚酯+糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫抑制方案治療，13例患者采用環(huán)孢素A+嗎替麥考酚酯+糖皮質(zhì)激素三聯(lián)免疫抑制方案治療。另外隨機(jī)選取同期10例腎穿刺活組織檢查正常的腎組織標(biāo)本作為對(duì)照組。

1.2 腎組織獲取 患者排空膀胱后取仰臥位，在彩色多普勒超聲探頭引導(dǎo)下，采用18 G穿刺槍，選取移植腎下極外側(cè)1/3區(qū)域作為穿刺點(diǎn)。囑患者在平靜呼吸狀態(tài)下屏氣，斜角(20～30°)進(jìn)針，經(jīng)皮膚、皮下至移植腎表面，避開(kāi)血管及腸管等重要器官，擊發(fā)穿刺針，拔出穿刺針后將獲取的組織作病理分析，每例患者均穿刺2次。穿刺后，穿刺部位局部敷料包扎，手按壓15 min后改用質(zhì)量為1 kg的鹽袋壓迫，囑患者平臥8 h以上，并觀察患者生命體征、尿液顏色和尿量等。3例移植腎切除組織均取自移植腎失功能切除患者。

1.3 病理檢查及免疫組織化學(xué)染色 穿刺獲得的組織標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋、切片，HE、PAS、Masson染色后進(jìn)行病理診斷，標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[6]。應(yīng)用鼠抗人IDO單克隆抗體(美國(guó)Chemicon公司)，按照二步法免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)說(shuō)明書進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)排斥反應(yīng)移植腎組織中IDO的表達(dá)情況。

1.4 結(jié)果分析 采用人工計(jì)數(shù)法，于光學(xué)顯微鏡下觀察組織切片的顯色反應(yīng)，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒、染色強(qiáng)度高于背景的非特異性染色為IDO陽(yáng)性細(xì)胞。在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不同視野，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)0～2%為陰性，3%～25%為弱陽(yáng)性，26%～50%為陽(yáng)性，>50%為強(qiáng)陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)及Fisher確切概率檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，2組間比較采用Nemenyi檢驗(yàn)，采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IDO在T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)移植腎及正常腎組織中的表達(dá) T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)移植腎組織中IDO陽(yáng)性表達(dá)率(73.7%)明顯高于正常腎組織(0)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)移植腎組織中IDO陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)移植腎組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1～3及表1。

2.2 IDO在T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)不同病理分析的移植腎組織中的表達(dá)情況 在T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)移植腎組織中，不同病理分級(jí)的移植腎組織中IDO陽(yáng)性表達(dá)率差異不同：T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織與T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅱ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織間的IDO陽(yáng)性表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.435)；T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織與T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅲ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織間的IDO陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.002)；T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅱ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織與T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅲ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織間的陽(yáng)性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.017)，見(jiàn)表1。Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，IDO的陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.696，P<0.05)。IDO在不同病理分級(jí)的T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)移植腎組織中的免疫組織化學(xué)染色情況見(jiàn)圖4～6。

圖1 正常腎臟穿刺組織(×400)

圖2 IDO在急性排斥反應(yīng)移植腎組織中表達(dá)(×400)

圖3 IDO在慢性排斥反應(yīng)移植腎組織中表達(dá)(×400)

表1IDO在不同腎組織中的表達(dá)

腎組織分類nIDO表達(dá)(n,%)陰性弱陽(yáng)性陽(yáng)性強(qiáng)陽(yáng)性總陽(yáng)性率/%正常腎組織1010(100.0)0(0.0)0(0.0)0(0.0)0.0 T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性排斥反應(yīng)腎組織105(50.0)5(50.0)0(0.0)0(0.0)50.0T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ級(jí)急性排斥反應(yīng)腎組織130(0.0)6(46.1)5(38.5)2(15.4)100.0T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅱ級(jí)急性排斥反應(yīng)腎組織101(10.0)8(80.0)1(10.0)0(0.0)90.0T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅲ級(jí)急性排斥反應(yīng)腎組織54(80.0)1(20.0)0(0.0)0(0.0)20.0

圖4 IDO在T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅰ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織中的表達(dá)(×400)

圖5 IDO在T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅱ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織中的表達(dá)(×400)

圖6 IDO在T細(xì)胞介導(dǎo)的Ⅲ級(jí)急性排斥反應(yīng)移植腎組織中的表達(dá)(×400)

3 討 論

IDO在人的器官組織細(xì)胞中均有表達(dá)，一些與排斥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞中表達(dá)尤為明顯，如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞[7]。此外，IDO還分布于一些免疫特赦或免疫耐受的組織中，如附睪、胃腸道黏膜、胎盤和胸腺等。IDO在這些組織中的免疫抑制作用機(jī)制可能與其對(duì)色氨酸的分解代謝及其代謝產(chǎn)物有關(guān)。正常人體內(nèi)的IDO生物活性很低，人體主要通過(guò)肝內(nèi)的色氨酸加氧酶(tryptophan dioxygenase，TDO)氧化代謝色氨酸。在器官移植后、妊娠狀態(tài)或存在自身免疫性疾病等非生理狀態(tài)時(shí)，體內(nèi)IDO表達(dá)顯著上調(diào)，血清中的色氨酸/犬尿氨酸比值也明顯降低[8-9]。

研究[10]顯示，正常情況下，腎組織中不表達(dá)IDO；而腎移植后由于不斷受到宿主的免疫攻擊，腎組織中可高表達(dá)IDO，說(shuō)明IDO可能在發(fā)生排斥反應(yīng)的移植腎中發(fā)揮一定作用。本研究結(jié)果亦顯示，正常腎組織中不表達(dá)IDO，T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)移植腎組織中IDO的陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)73.7%。當(dāng)IDO處于高表達(dá)、高活性狀態(tài)時(shí)，其產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)可以有效地對(duì)抗T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，此時(shí)T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率較低，排斥反應(yīng)的級(jí)別也較低；在IDO表達(dá)較少、活性較低的情況下，其免疫抑制效應(yīng)不能有效地對(duì)抗T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，此時(shí)T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)的發(fā)生率較高，排斥反應(yīng)的級(jí)別較高。本研究進(jìn)行的Spearman等級(jí)相關(guān)分析也表明，隨著IDO表達(dá)強(qiáng)度的提高，T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)強(qiáng)度逐漸降低，這可能與低表達(dá)的IDO所產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)減弱有關(guān)。

綜上所述，腎移植術(shù)后，由于受體免疫狀態(tài)的改變，免疫細(xì)胞不斷刺激移植腎，誘導(dǎo)移植腎組織中IDO的表達(dá)，其表達(dá)強(qiáng)度與T細(xì)胞介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)的程度呈負(fù)相關(guān)，高表達(dá)的IDO可能會(huì)抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的排斥反應(yīng)。

[1]Padiyar A,Akoum FH,Hricik DE.Management of the kidney transplant recipient[J].Prim Care,2008,35(3):433-450.

[2]Giral M,Foucher Y,Karam G,et al.Kidney and recipient weight incompatibility reduces long-term graft survival[J].J Am Soc Nephrol,2010,21(6):1022-1029.

[3]Yeates K,Wiebe N,Gill J,et al.Similar outcomes among black and white renal allograft recipients[J].J Am Soc Nephrol,2009,20(1):172.

[4]Takikawa O.Biochemical and medical aspects of the indoleamine 2,3-dioxygenase-initiated L-tryptophan metabolism[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,338(1):12-19.

[5]Frumento G,Rotondo R,Tonetti M,et al.Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxygenase[J].J Exp Med,2002,196(4):459-468.

[6]Solez K,Colvin RB,Racusen LC,et al.Banff 07 classification of renal allograft pathology:updates and future directions[J].Am J Transplant,2008,8(4):753-760.

[7]Mellor AL,Munn DH.IDO expression by dendritic cells:tolerance and tryptophan catabolism[J].Nat Rev Immunol,2004,4(10):762-764.

[8]Espey MG,Namboodiri MA.Selective metabolism of kynurenine in the spleen in the absence of indoleamine 2,3-dioxygenase induction[J].Immunol Lett,2000,71(1):67-72.

[9]Hainz U,Obexer P,Winkler C,et al.Monocyte-mediated T-cell suppression and augmented monocyte tryptophan catabolism after human hematopoietic stem-cell transplantation[J].Blood,2005,105(10):4127-4134.

[10]Brandacher G,Cakar F,Winkler C,et al.Non-invasive monitoring of kidney allograft rejection through IDO metabolism evaluation[J].Kidney Int,2007,71(1):60.