耐萬古霉素腸球菌耐藥表型檢測和基因型分析

張俠家，沈繼錄，賈偉華

耐萬古霉素腸球菌耐藥表型檢測和基因型分析

張俠家1，2，沈繼錄1，2，賈偉華3

目的 研究某院耐萬古霉素腸球菌（VRE）的耐藥特性、基因型及流行情況。方法 采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗;使用E-test法檢測VRE對萬古霉素的最低抑菌濃度（MIC），PCR法檢測萬古霉素的耐藥基因，BLAST法對6株PCR產物測序結果比對分析其氨基酸序列。結果 193株腸球菌中檢出6株萬古霉素耐藥屎腸球菌;該菌株對高單位慶大霉素、氨芐西林、環丙沙星、紅霉素、利福平、替考拉寧均耐藥，對呋喃妥因和利奈唑胺均敏感，對萬古霉素的MIC值均＞256 mg/L;基因型均為vanA;6株菌的vanA基因均有氨基酸發生了改變，其中5株菌均發生第83位氨基酸突變，由天冬酰胺（AAC）→天冬氨酸（GAC）。結論 我院VRE多為多重耐藥，給臨床治療VRE感染帶來困難，醫院應加強預防監測，阻止其在院內的傳播和流行。

萬古霉素;耐藥性;腸球菌;表型;基因型

腸球菌屬可導致尿路感染、皮膚軟組織感染，甚至會引起危及生命的腹腔感染、敗血癥、心內膜炎和腦膜炎。近年來，腸球菌耐藥菌株的不斷出現，耐藥水平也迅速上升［1］。隨著 1988年英國首次報道［2－3］了耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistantEnterococci，VRE），世界各地陸續有VRE被發現，并且世界各國VER檢出率非常高，近年我國許多地區VRE也有一定檢出率［4］。現對安徽醫科大學第一附屬醫院2011年分離到的6株VRE進行分析，為臨床治療VRE用藥、控制院內傳播及進行流行病調查提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集安徽醫科大學第一附屬醫院2011年1月～12月臨床分離的193株腸球菌 （剔除來自同一患者的重復株），其中糞腸球菌59例，屎腸球菌131例，鳥腸球菌3例。

1.2 質控菌株 金黃色葡萄球菌ATCC 25923和糞腸球菌ATCC 29212均購自衛生部臨床檢驗中心。

1.3 主要儀器設備 MicroScan WalkAWay-96plus全自動微生物分析系統購自美國西門子公司;電泳儀（天能ESP 300）購自上海天能公司;PCR擴增儀購自德國Biometra公司;凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司。

1.4 培養基和試劑 M-H瓊脂培養基為英國OXOID公司商品;PCR檢測試劑Ex Taq酶、Ex Taq Buffer及dNTPs均為日本TaKaRa公司商品。

1.5 抗菌藥物 高單位慶大霉素（120 μg）、氨芐西林、環丙沙星、氯霉素、磷霉素、紅霉素、利福平、呋喃妥因、利奈唑胺、替考拉寧、萬古霉素11種藥物紙片均購自英國OXOID公司;E-test紙條購自法國生物梅里埃公司。

1.6 藥敏試驗 采用K-B紙片法進行藥敏試驗，結果判斷依據美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）文件2011版標準。紙片法萬古霉素耐藥菌株再采用E-test紙條確認最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentrations，MIC）。耐藥株選擇標準:E-test紙條測定對萬古霉素的MIC ＞256 mg/L。

1.7 PCR 引物 引物依據參考文獻［5－6］進行設計，由上海生物工程公司合成。見表1。

1.8 腸球菌萬古霉素耐藥基因檢測 應用PCR對van耐藥的菌株進行耐藥基因的擴增，包括:vanA、vanB 、vanC1和 vanC2－3型基因;PCR 反應條件與過程如下:挑取純培養菌落置入去離子水中配制成懸液，100℃煮沸10 min，8 000 r/min離心5 min，上清液即為模板液。PCR反應體積為50 μl，包括4 μl的模板液，上下游引物各 2 μl（10 μmol/L），4 μl dNTPs（200 μmol/L），0.25 μl Ex Taq 酶（1.6 U），5 μl Ex Taq Buffer，去離子水 32.8 μl。擴增條件:預變性93℃ 2 min;變性93℃ 1 min，退火55℃ 1 min，延伸72℃ 1 min，共35個循環;最后72℃延伸2 min，停止4℃。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，取出用BIO-RAD顯像，拍照觀察結果。

1.9 PCR產物測序分析 PCR陽性擴增產物送交上海生物工程公司測序。以屎腸球菌（taxid:1352）為陽性對照，將測序結果在GenBank序列數據庫進行基因同源性分析（BLAST）。

表1 van基因PCR引物序列及產物大小

2 結果

2.1 6 株耐萬古霉素屎腸球菌（vancomycin-resistantEnterococci Faecium，VREFm）藥敏試驗 K-B紙片法測定6株VREFm對11種抗菌藥物的耐藥率，結果顯示VREFm對高單位慶大霉素、氨芐西林、環丙沙星、氯霉素、紅霉素、利福平100%耐藥;對磷霉素耐藥性呈現出差異;對呋喃妥因和利奈唑胺均敏感，對替考拉寧耐藥。見表2。

2.2 6 株VREFm基因檢測 6株耐藥屎腸球菌經PCR擴增后均為vanA陽性基因，片段783 bp。未檢測出vanB、vanC1和 vanC2-3型基因。見圖1。

2.3 6 株PCR產物基因測序 從vanA基因表達陽性菌株中，進行vavA基因的測序，發現6株菌vanA基因均有氨基酸的突變，其中5株菌均發生第83位氨基酸突變Asn（AAC）→Asp（GAC），見表3。

3 討論

萬古霉素是治療革蘭陽性菌感染的一種重要的糖肽類抗生素，被認為是治療嚴重腸球菌感染的“最后一道防線”。然而近年來，隨著萬古霉素在臨床應用治療腸球菌感染逐漸增多，使得VRE感染率迅速增加［7］，給臨床治療帶來了困難。本研究對我院2011年分離的193株腸球菌進行藥敏試驗，結果篩選出6株VRE，耐藥率占3.1%，低于國內外的相關報道［2，8］，并且藥敏試驗顯示6株 VRE 全部是屎腸球菌。屎腸球菌對大多數抗菌藥的耐藥率高于糞腸球菌，并且屎腸球菌對大多數抗生素天然耐藥，提示屎腸球菌耐藥形勢比糞腸球菌嚴峻［9］，使臨床治療VRE感染更加棘手。

圖1 vanA基因的PCR產物電泳圖

表2 6株VREFm對11種抗菌藥物的耐藥率（%）

表3 6株VREFm的vanA基因氨基酸突變情況

目前，VRE耐藥表型和基因型均可分為vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM 和 vanN 9型［10］，其中vanA型為主要類型，對萬古霉素和替考拉寧均耐藥，其次為vanB型，表現為對萬古霉素不同程度耐藥而對替考拉寧敏感，vanC型對萬古霉素敏感而對替考拉寧耐藥。我院檢出的6株VRE基因型均是vanA型，并且6株菌vanA基因均有氨基酸的突變，其中5株菌均發生第83位氨基酸突變Asn（AAC）→Asp（GAC）。6株vanA基因表達陽性菌株，對萬古霉素耐藥，其編碼基因發生突變可能導致其編碼的蛋白高表達，從而導致對萬古霉素MIC的進一步提升，具體機制還有待進一步研究。vanA是腸球菌中最常見的耐糖肽類抗菌藥物的耐藥型，也是迄今為止唯一一個能在金黃色葡萄球菌中檢出的耐藥類型;vanA型耐藥基因可由質粒介導傳遞給金黃色葡萄球菌，產生耐萬古霉素金黃色葡萄球菌（VRSA）。VRSA的毒力和侵襲力更大，使目前存在的抗菌藥物面臨極大挑戰。因此，要規范化使用抗菌藥物，要不斷完善實驗室對VRE的檢測，做到快速分離和鑒定，如果發現有VRE應及時與醫院有關部門取得聯系，做好消毒隔離工作，定期檢測醫院耐藥菌株對常用抗菌藥物的耐藥情況，防止VRE在醫院內的交叉感染和傳播。

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Detection of phenotype and analysis of genotype in vancomycin-resistantEnterococci

Zhang Xiajia1，2，Shen Jilu1，2，Jia Weihua3
（1Dept of Clinical Laboratory Diagnostics，3The First Clinical College，Anhui Medical University，Hefei230032;2Dept of Medical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230022）

ObjectiveTo research the resistant characteristics，genotype and prevalence of vancomycin-resistantEnterococci（VRE）.MethodsK-B disc diffusion method was used to determine the susceptibility，minimum inhibitory concentration（MIC）for vancomycin of VRE was detected by E-test method;VRE was then subjected to PCR for resistance related genes;6 strains sequencing results of PCR product were contrastively analyzed the amino acid sequence by BLAST.Results6 VREFm strains were found from 193 strains enterococci;6 VREFm strains were completely resistant to high unit gentamicin，ampicillin，ciprofloxacin，teicoplanin，but were sensitive to linezolid and macrodantin，MIC for vancomycin was more than 256 mg/L;Genotypes were vanA;Amino acids in vanA gene have changed with Asn83→Asp（AAC→GAC）.ConclusionVRE in our hospital is mostly multi-drug resistant，

which bringS difficulty in clinical treatment for its infection.So the hospital should strengthen the prevention and monitoring，to prevent the spread of VRE strains in the hospital and popular.

vancomycin;drug resistance;enterococci;phenotype;genotype

R 378.1;R 446.5;R 453.2

A

1000－1492（2014）05－0662－03

2014－02－17接收

國家自然科學基金（編號:81171618）

安徽醫科大學1臨床檢驗診斷學教研室、3第一臨床學院，合肥 230032

2安徽醫科大學第一附屬醫院檢驗科，合肥 230022

張俠家，女，碩士研究生;

沈繼錄，男，博士，副主任技師，碩士生導師，責任作者，E-mail:shenjilu@126.com