蘇云金芽孢桿菌的生物防治安全性研究進展

曹瓊+倪超超

摘要:蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt)是目前全球應用最成功的生物殺蟲劑之一。然而近10 年多的研究成果表明,一直以來人們認為對人畜無毒性的蘇云金芽孢桿菌的安全性問題受到質疑,一些專家認為有必要通過現代生物技術對蘇云金芽孢桿菌進一步改良,重新選育一些安全性更可靠、殺蟲效率更高的Bt菌株應用于生物防治,以避免其對人畜的可能毒害。

關鍵詞:蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,Bt);生物防治;安全性;遺傳改良;活性成分

中圖分類號:S476.1;Q936文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)11-2485-05

Advances on the Safety of Biological Control with Bacillus thuringiensis

CAO Qiong1,NI Chao-chao2

(1. Wuhan City Vocational College, Wuhan 430064, China;

2.Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China)

Abstract: Bacillus thuringiensis is one of the most successful biological insecticides applied so far in the world. However, some reports in the past ten years showed that people doubted the safety of Bacillus thuringiensis, which was considered non-toxic to human and animals. Some experts thought that it was necessary to develop new Bt strains with better safety and efficiency with modern biological technology to avoid potential toxicity to human and animals.

Key words: Bacillus thuringiensis; biological control; safety; genetic improvement; active ingredient

蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis,簡稱 Bt)是一類能引起昆蟲致病的病原菌,1901年首次發現于日本,1938年作為生物殺蟲劑成為商品。自20世紀50年代Bt商品工業化以來,就以其高效安全、對人畜沒有毒性、能特異殺滅目標害蟲、對自然環境也不造成污染而成為全球應用最成功的生物殺蟲劑之一,也是目前研究最深入的生物殺蟲劑。

目前Bt作為應用總量最大的生物殺蟲劑,卻只占農藥總用量的2%~3%,這距離世界環境與發展大會確定的到2015年生物農藥的使用將占農藥總用量50%以上的要求還相差甚遠,因此提升Bt生物農藥的應用安全性和殺蟲功效仍然具有深遠的意義和研究價值。

1Bt的特性

蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus,Bc)、蘇云金芽孢桿菌、覃狀芽孢桿菌(Bacillus mycoides,Bm)、假真菌樣芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides,Bp)、炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis,Ba)以及韋氏芽孢桿菌(Bacillus weihenstephanensis,Bw)全部歸類于蠟狀芽孢桿菌群。

Bt是一種在自然界廣泛分布的好氣性芽孢桿菌,在昆蟲、土壤、儲藏品及其塵埃、污水和植被上都有分布,革蘭氏染色陽性。其細胞長度不到0.005 mm,當它生長到一定階段,細胞一端會形成一個卵圓形的芽孢,用來繁殖后代,另一端會形成一個菱形或近似正方體的結晶體,因為與芽孢相伴而生被稱為伴孢晶體,也稱δ-內毒素[1],是一種或多種殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal proteins,簡稱ICPs),有很強的殺蟲毒性。

Bt的生活史為芽孢萌發-營養生長-內部形成芽孢和伴孢晶體-芽孢囊破裂釋放出芽孢和伴孢晶體等過程。

2Bt的活性成分

大量的研究使人們認識了越來越多的Bt的活性成分[2],特別是其非殺蟲活性成分的逐一發現,使人們對Bt的認識更進一步深入。

Bt的殺蟲活性成分有幾丁質酶、殺蟲晶體蛋白(δ-內毒素)、磷酯酶C(α-外毒素)、蘇云金素(β-外毒素)、溶血素、腸毒素、營養期殺蟲蛋白、芽孢等[3]。而雙效菌素、輔助蛋白和自身誘導物抑制蛋白等不具有直接的殺蟲活性。其具體分類情況如表1所示。

2.1營養期殺蟲蛋白

營養期殺蟲蛋白(VIPs)是一類Bt在營養期分泌的可溶性新型殺蟲蛋白。此殺蟲蛋白基因的種類僅有VIP3A(a)、VIP3A(b)和VIP-s,目前尚未定位。殺蟲機理與殺蟲晶體蛋白基因相似,即通過與敏感昆蟲中腸上皮細胞受體結合,使中腸溶解而致死。

2.2幾丁質酶

大量研究證明Bt的幾丁質酶(Chitinase)本身對昆蟲的毒殺作用并不明顯,但是能增強殺蟲晶體蛋白的殺蟲作用,原因是昆蟲中腸圍食膜(大多數昆蟲中腸內壁附著的一層起潤滑和保護作用的半透性黏膜)的主要成分幾丁質和蛋白質,是昆蟲防治病原菌和病毒的屏障,當Bt進入其中腸后分泌的幾丁質酶將圍食膜破壞,然后殺蟲晶體蛋白進一步作用造成中腸穿孔而導致昆蟲死亡。

2.3磷酯酶C

磷酯酶C(Phospholipase C)是一類可催化磷酯C3上的磷酯酰鍵的蛋白水解酶,在細胞代謝和信息傳遞等方面起著重要作用。

Bt的磷酯酶有兩種,一種是磷脂酞膽堿特異的磷脂酶(簡稱PCH),另一種是磷脂酞肌醇特異的磷脂酶(簡稱PIH),都是α-外毒素。

2.4溶血素

溶血素(Hemolysin)是一種潛在的Bt孢外致病因子,其作用是當Bt菌株附著到昆蟲腸壁細胞后腸壁潰爛,菌株迅速通過淋巴系統進入血系統,分泌溶血素引起溶血作用,使昆蟲患敗血癥而死亡,由于其過程相對緩慢,因此具有一定的潛伏性。

已經發現了很多Bt的溶血素種類,如溶血素Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、BL、溶細胞素AB和神經磷脂酶等,而在Bt中僅發現了溶血素Ⅱ。

2.5蘇云金素

蘇云金素(Thuringiensin)主要存在于血清型H1的Bt菌株,有H4ac、H5、H7~H12 8種,是一類腺嘌呤核苷酸衍生物,能抑制RNA聚合酶活性,在細菌生長時被分泌到細胞外,都是β-外毒素。

蘇云金素對蠅類有很強的毒力,作用過程緩慢,作用機制發生在昆蟲蛻皮和變態階段,這兩個階段RNA合成旺盛,蘇云金素通過抑制RNA聚合酶活性,阻斷DNA的表達,對人類和動物有一定的毒性。

2.6雙效菌素

雙效菌素(Zwitternicin)是一種氨基多元醇類廣譜抗生素,蘇云金亞種、庫斯塔克亞種等17種不同的亞種均能產生雙效菌素。其主要作用是抑制霉菌的生長繁殖,在霉菌還沒侵染植物前,噴施雙效菌素可起到預防植物病害的作用,此外,雙效菌素對Bt的殺蟲活性還具有一定的增效作用。

2.7殺蟲晶體蛋白(Insecticidal crystal protein, ICPs)

殺蟲晶體蛋白是Bt殺蟲的主要毒素成分,又叫δ-內毒素[4]。

2.7.1殺蟲晶體蛋白的種類殺蟲晶體蛋白的種類繁多,目前已知并命名的有230多種。其中大多數是Cry蛋白,對鱗翅目、雙翅目或鞘翅目幼蟲有毒;少數是Cyt蛋白,活體條件下只對雙翅目幼蟲有較弱的毒性,離體條件下具有廣譜性毒性[5]。

用于防治鱗翅目害蟲殺蟲劑的主要來自庫斯塔克亞種(Subsp kurstaki)、蘇云金亞種(Subsp thuring

iensis)和鲇澤亞種(Subsp aizawai)的Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac三個高毒力晶體蛋白基因,其中Cry1Ac殺蟲毒力最強,來自鲇澤亞種;擬步行甲亞種(Subsp. tenebrionis)的殺蟲蛋白Cry3A對鞘翅目馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decenlineata)具有較強的毒力;來自日本亞種(Subsp japonensis)的Cry8C殺蟲晶體蛋白對鞘翅目金龜子類幼蟲有殺蟲毒力;以色列亞種(Subsp istealeosis)的殺蟲蛋白至少有Cry4A、Cry4B、Cry11A和Cyt1A四種,能殺死蚊蚋幼蟲,其中Cry11A的活性最高,除了具有抗雙翅目昆蟲活性外,還具有溶解無脊椎動物和脊椎動物細胞的活性;1999年日本的Mizuki等[6]發現了某些沒有殺蟲能力的81kD伴孢晶體蛋白,水解活化后對體外培養的人類白血病T細胞和人類子宮頸癌細胞具有殺傷能力,該蛋白的基因是Cry31Aal,這是繼發現以色列亞種后又一個與醫學相關的基因,有望為抗癌研究的發展和生物制藥開辟新的方向;近年來發現了一些與Bt具有一定同源性的殺蟲晶體蛋白基因如Cryl8Aal,它與Cry2A具有40%的相似性,來自金龜子芽孢桿菌(Baoillus popilliae),這是一類對金龜子幼蟲專性寄生的細菌,以后又陸續發現了Cry18Ba和Cry18Ca。

2.7.2殺蟲晶體蛋白的作用過程和基因定位殺蟲晶體蛋白被昆蟲取食后,迅速作用于昆蟲的中腸,致使腸壁出現微孔,昆蟲立刻停止取食,腸道內膜很快遭到破壞,Bt菌株穿過腸道進入血淋巴系統和血系統,最后昆蟲因饑餓和敗血癥而死亡[7,8]。

大量研究證明了編碼殺蟲晶體蛋白(ICPs)的結構基因和調節基因主要位于大質粒上,只有少數位于染色體上[9,10]。

2.8免疫抑制因子A

Bt的免疫抑制因子A(Immune inhibitor A, InA)是一種能產生免疫反應,引起生物體致病的酶類活性因子,能夠分解寄主產生的抗菌蛋白,通過消化免疫球蛋白IgG和IgA引起寄主致病作用。

2.9腸毒素

腸毒素(Enterotoxin)是引起食物中毒的致病物質,是一類水溶性蛋白質,食品中的腸毒素不因熱加工而滅活,對蛋白酶也有耐性,故在消化道中不易被破壞。

目前已發現了3種腸毒素:無溶血腸毒素NHE、溶血腸毒素HBL和枯草桿菌毒素T,只有HBL具有溶血活性。研究證實Bt的庫斯塔克亞種和以色列亞種的商業菌株中含有腸毒素基因并且具有溶血活性,只是目前尚未見腸毒素影響人類健康的報道。

2.10輔助蛋白

輔助蛋白(Help protein)能促進殺蟲晶體蛋白的殺蟲作用,也可能是以分子伴侶的形式參與殺蟲晶體蛋白的構成,對穩定殺蟲晶體蛋白的結構有作用。

2.11自身誘導物抑制蛋白

自身誘導物是一類存在于植物的病原菌細胞間傳遞信息的信號分子,當自身誘導物達到一定濃度時,就能激活病原菌中某些特殊毒素基因的表達,促使病原菌對植物產生致病作用。

有研究表明,在Bt菌株中存在一種抑制蛋白,能抑制病原菌細胞內的自身誘導物,這種抑制蛋白被稱為自身誘導物抑制蛋白。它是一種孢內活性成分,影響病原菌致病的作用原理可能是由于降低了病原菌細胞內自身誘導物的濃度,而使自身誘導物達不到激活某些特殊毒素基因表達的水平。

2.12芽孢

芽孢是Bt的繁殖結構。很多研究表明,芽孢本身對昆蟲的毒力很低,只有通過與殺蟲晶體蛋白協同作用才能達到殺蟲效果。芽孢殺蟲機理是在伴孢晶體使中腸潰瘍后,芽孢進入血系統萌發并生長,在生長過程中產生的多種外毒素及酶使幼蟲患敗血癥而致死。

3Bt在農林業中的廣泛應用

為了減少蟲害,確保糧食產量,每年全世界要使用200多萬t的化學農藥,金額高達160億美元。然而,大量使用化學農藥會帶來許多憂慮,如生態平衡的破壞,引起人畜中毒,長期使用昆蟲還會產生抗藥性,使化學農藥的用量越來越大等問題[11,12]。

與化學農藥相比,生物殺蟲劑具有低成本、高效安全、對目標害蟲的特異性、對人畜無毒性等特性,對自然界也不造成污染。Bt作為生物殺蟲劑應用于農林業生產已經有幾十年的歷史。迄今為止已鑒定了Bt的70個血清型,83個亞種,其中我國發現41個血清型。它對無脊椎動物中的4個門,線形動物門、原生動物門、扁形動物門中某些有害種類和節肢動物中的10個目(如鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、膜翅目、直翅目、等翅目、蜚螺目、毛翅目和蚤目等)的近600多種昆蟲有特異活性。

我國研究和應用Bt始于1959年;1965年進行了工業化生產;自20世紀80年代以來,我國Bt規模進一步擴大,目前已經成為主要的生物殺蟲劑[11]。我國對Bt有敏感特異的昆蟲在125種以上。

4Bt的安全性分析和遺傳改良

4.1Bt的安全性分析

4.1.1對生態系統的影響Bt的廣泛使用會殺死大量對作物無害甚至是對環境有益的昆蟲,這些昆蟲對生態系統的結構和功能是非常重要的。例如,很多鳥類以昆蟲的幼蟲為食,Bt的廣泛使用會導致這些地區鳥的種類和分布減少;未降解的Bt制劑流入水域,也會引起水生動物的中毒或致死。

4.1.2對人和哺乳動物的影響一直以來人們都認為Bt在生物防治中對人和哺乳動物沒有危害,之所以這樣認為可能有兩個原因,一是Bt腸毒素基因與Bc腸毒素基因有差異,使得Bt腸毒素的致病性低于Bc腸毒素;另一原因可能是Bt菌株引起的一些感染特征與Bc引起的感染特征相似而被誤檢為Bc。

隨著對Bt研究的逐步深入,其活性成分逐漸知曉,特別是其非殺蟲活性成分的發現,如溶血素(Hemolysin)、蘇云金素(Thuringiensin)、免疫抑制因子A(InA)、腸毒素(Enterotoxin)等,使人們對Bt有了新的認識,有些Bt菌株對人和哺乳動物也可能存在毒性。近來有研究表明,Bt與Bc和Ba之間有著很近的親緣關系,同源程度很高,有試驗表明Bt、Bc和Ba的很多基因的同源性在95%以上,在臨床上最常見的危害是導致食物中毒,也可能引起膿腫、腦膜炎、骨髓炎、心膜炎等,從而使科學家擔心其大量使用的安全可靠性。已有研究發現,在有些Bt商品中含有類似的能引起人畜條件致病的活性成分,如庫斯塔克亞種和以色列亞種的商業菌株中含有腸毒素基因并具有溶血活性[13,14]。并且在臨床感染的組織中也分離出了Bt菌株,但是,未被證明是否具有感染能力。還有,殺蟲質粒和其上的人致病毒素基因在不同菌株之間可以以很低的頻率互相轉移,這也增加了Bt對人畜的潛在危險性[15,16]。

鑒于以上事實,特別是Bt對人和哺乳動物的毒性,致使有些科學家提出Bt對人畜的安全性有待進一步提升,因此有必要重新選育一些安全性更可靠、殺蟲效率更高的Bt菌株應用于生物防治,以避免其對人的可能毒性。

4.2Bt的遺傳改良

從自然環境中很難直接分離出不含腸毒素基因,且不產生腸毒素溶血活性同時又具有高效殺蟲質粒的Bt菌株。接合轉移是一種新的遺傳改良方式,是通過基因剔除使Bt的病原因子失活或選擇不含腸毒素基因無溶血活性的Bt或Bc宿主菌,導入高效殺蟲質粒進行遺傳改良,從而篩選出一些既無致病危害又保留高效殺蟲毒力的重組菌株。2003年Yang等[17]把Cry1Ac基因轉移到一個沒有溶血活性的庫斯塔克亞種中,結果獲得的新菌株的殺蟲活性與原來的庫斯塔克亞種親本菌株的殺蟲活性幾乎一樣。

經過多年的研究積累,Bt的遺傳改良工作取得了以下成果。

改良出蠟狀芽孢桿菌DBt248,其不含溶血素hbl基因、非溶血素nhe基因、病原調控因子plcR和pXO1-ORF101相似片斷,因而沒有溶血活性,有望作為宿主菌用于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的表達以構建安全高效的殺蟲工程菌株[18]。

含有殺蟲晶體蛋白基因cry1Ac的高效殺蟲質粒pHT73能以自然接合轉移的方式轉移到兩株庫斯塔克亞種、1株覃狀芽孢桿菌、5株蠟狀芽孢桿菌和1株不含致病因子的達姆斯特變種中。接合子菌株能表達相應的殺蟲晶體蛋白。有試驗證明pHT73質粒在庫斯塔克亞種中的轉移率較高[18]。

將編碼有多種殺蟲毒素基因的大質粒pBtoxis接合轉移至蠟狀芽孢桿菌群菌株間,發現pBtoxis的宿主范圍比pHT73窄,轉移效率也較低,只有10-8接合子/受體,而且必須在接合輔助質粒的幫助下發生轉移。pBtoxis能在芽孢形成期表達多種毒素蛋白[18]。

將無腸毒素基因不產生無腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌導入pBtoxis質粒或pHT73質粒后,接合子也無溶血性。研究表明,用無腸毒素基因不產生無腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌作為宿主菌,以接合轉移的方式構建安全的Bt工程菌的設想是可行的[18]。

plcR基因是一種調控基因,能調控溶血素基因、腸毒素基因等基因的活性。用插入失活的方式破壞plcR基因可以使以色列亞種AND672的溶血活性降低。plcR基因的失活不影響殺蟲蛋白基因的表達,也不影響其殺蟲活性[18]。

以HD-1為初始誘變株經紫外線、亞硝基胍、N+離子等注入誘變,篩選出5株對棉鈴蟲有高毒力的誘變株,B47、B28、S159、B209和S218,其毒力分別提升87%、140%、87%、92%和100%,傳代10代后其毒力沒有明顯下降[19]。

另外,利用基因工程技術,任何生物體都可以獲得并表達Cry殺蟲晶體蛋白,這也是Bt遺傳改良的又一方向。近30年來,隨著轉Bt基因作物[20-22](轉Bt基因番茄、轉Bt基因煙草、轉Bt基因棉花、轉Bt基因水稻以及轉Bt基因玉米等)的不斷問世,Bt在生物防治方面的推廣速度和效果使農林業的發展進入了新的產業化階段。

以上成果說明,將現代分子生物學技術應用于Bt菌株的遺傳改良,可以很好地提高其殺蟲活性和安全性。

參考文獻:

[1] SCHNEPF E, CRICKMORE N, VAN RIE J. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 1998,62(3):775-806.

[2] 蔡啟良,劉子鐸,喻子牛.蘇云金芽胞桿菌生物活性成分研究進展[J].應用與環境生物學報,2003,9(2):207-212.

[3] 李雪,馬玉超,李煦,等.蘇云金芽胞桿菌伴孢晶體的研究進展[J].安徽農業科學,2012,40(1):5920-5924.

[4] KUMAR P A, SHARMA R P, MALIK V S. The insecticidal protein of Bacillus thuringiensis[J]. Adv Appl Microbiol, 1996,42:l-43.

[5] 李雪雁,李照會,許維岸.蘇云金芽孢桿菌cry基因研究進展[J].昆蟲知識,2003,40(1):9-13.

[6] MIZUKI E,OHBA M, AKAO T, et al. Unique activity associated with non-insecticidal Bacillus thuringiensis parasporal inclusion:in vitro cell-killing action cancer cells[J]. J Appl Microbiol,1999,86:477-486.

[7] 劉冰花,周紅,張定玲.蘇云金芽胞桿菌的研究進展[J].成都大學學報(自然科學版),2007,26(1):9-13.

[8] ARONSON A I, SHAI Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: Unique features of their mode of action[J]. FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):1-8.

[9] KRONSTAD J W, SCHNEPF H E, WHITELEY H R. Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes[J]. J Bacteriol, 1983,154(1):419-428.

[10] WHITELEY H R, SCHNEPF H E. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis[J]. Annu Rev Microbiol,1986,40:549-576.

[11] 唐韻.我國生物農藥登記品種及其使用技術[J].農藥市場信息,2013(7):39-40.

[12] 喻子牛.蘇云金芽胞桿菌[M].北京:科學出版社,1990.

[13] HANSEN B M, HENDRIKSEN N B. Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2001,67(1):185-189.

[14] 袁志明,蔡全信,ANDRUP L,等.蘇云金芽胞桿菌腸毒素基因的PCR檢測[J].微生物學報,2001,41(2):148-154.

[15] VAN DER AUWERA G A,TIMMERY S, MAHILLON J,et al. Plasmid exchanges among members of the Bacillus cereus group in foodstuffs[J]. Int J Food Microbiol,2006,113:164-172.

[16] 黃必旺.蘇云金芽孢桿菌的腸毒素及其安全性研究[D].福州:福建農林大學,2005.

[17] YANG C Y, PANG J C, KAO S S, et al. Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production[J]. J Agric Food Chem, 2003,51(1):100-105.

[18] 胡曉敏.蠟狀芽孢桿菌群菌株病原相關分析及其遺傳改良[D].武漢:中國科學院研究生院(武漢病毒研究所),2007.

[19] 劉坤.蘇云金芽孢桿菌高毒菌株菌種選育和制劑研究[D].合肥:合肥工業大學,2011.

[20] 李桂玲,李明澤,李春奇,等.轉Bt基因玉米研究進展[J].安徽農業科學,2008,36(32):14027-14029.

[21] 王北艷,殷奎德.轉Bt抗蟲基因水稻生物安全性探討[J].江蘇農業科學,2012,40(9):271-273.

[22] 陸宴輝.Bt棉花害蟲綜合治理研究前沿[J].應用昆蟲學報,2012,49(4):809-819.

4.2Bt的遺傳改良

從自然環境中很難直接分離出不含腸毒素基因,且不產生腸毒素溶血活性同時又具有高效殺蟲質粒的Bt菌株。接合轉移是一種新的遺傳改良方式,是通過基因剔除使Bt的病原因子失活或選擇不含腸毒素基因無溶血活性的Bt或Bc宿主菌,導入高效殺蟲質粒進行遺傳改良,從而篩選出一些既無致病危害又保留高效殺蟲毒力的重組菌株。2003年Yang等[17]把Cry1Ac基因轉移到一個沒有溶血活性的庫斯塔克亞種中,結果獲得的新菌株的殺蟲活性與原來的庫斯塔克亞種親本菌株的殺蟲活性幾乎一樣。

經過多年的研究積累,Bt的遺傳改良工作取得了以下成果。

改良出蠟狀芽孢桿菌DBt248,其不含溶血素hbl基因、非溶血素nhe基因、病原調控因子plcR和pXO1-ORF101相似片斷,因而沒有溶血活性,有望作為宿主菌用于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的表達以構建安全高效的殺蟲工程菌株[18]。

含有殺蟲晶體蛋白基因cry1Ac的高效殺蟲質粒pHT73能以自然接合轉移的方式轉移到兩株庫斯塔克亞種、1株覃狀芽孢桿菌、5株蠟狀芽孢桿菌和1株不含致病因子的達姆斯特變種中。接合子菌株能表達相應的殺蟲晶體蛋白。有試驗證明pHT73質粒在庫斯塔克亞種中的轉移率較高[18]。

將編碼有多種殺蟲毒素基因的大質粒pBtoxis接合轉移至蠟狀芽孢桿菌群菌株間,發現pBtoxis的宿主范圍比pHT73窄,轉移效率也較低,只有10-8接合子/受體,而且必須在接合輔助質粒的幫助下發生轉移。pBtoxis能在芽孢形成期表達多種毒素蛋白[18]。

將無腸毒素基因不產生無腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌導入pBtoxis質粒或pHT73質粒后,接合子也無溶血性。研究表明,用無腸毒素基因不產生無腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌作為宿主菌,以接合轉移的方式構建安全的Bt工程菌的設想是可行的[18]。

plcR基因是一種調控基因,能調控溶血素基因、腸毒素基因等基因的活性。用插入失活的方式破壞plcR基因可以使以色列亞種AND672的溶血活性降低。plcR基因的失活不影響殺蟲蛋白基因的表達,也不影響其殺蟲活性[18]。

以HD-1為初始誘變株經紫外線、亞硝基胍、N+離子等注入誘變,篩選出5株對棉鈴蟲有高毒力的誘變株,B47、B28、S159、B209和S218,其毒力分別提升87%、140%、87%、92%和100%,傳代10代后其毒力沒有明顯下降[19]。

另外,利用基因工程技術,任何生物體都可以獲得并表達Cry殺蟲晶體蛋白,這也是Bt遺傳改良的又一方向。近30年來,隨著轉Bt基因作物[20-22](轉Bt基因番茄、轉Bt基因煙草、轉Bt基因棉花、轉Bt基因水稻以及轉Bt基因玉米等)的不斷問世,Bt在生物防治方面的推廣速度和效果使農林業的發展進入了新的產業化階段。

以上成果說明,將現代分子生物學技術應用于Bt菌株的遺傳改良,可以很好地提高其殺蟲活性和安全性。

參考文獻:

[1] SCHNEPF E, CRICKMORE N, VAN RIE J. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 1998,62(3):775-806.

[2] 蔡啟良,劉子鐸,喻子牛.蘇云金芽胞桿菌生物活性成分研究進展[J].應用與環境生物學報,2003,9(2):207-212.

[3] 李雪,馬玉超,李煦,等.蘇云金芽胞桿菌伴孢晶體的研究進展[J].安徽農業科學,2012,40(1):5920-5924.

[4] KUMAR P A, SHARMA R P, MALIK V S. The insecticidal protein of Bacillus thuringiensis[J]. Adv Appl Microbiol, 1996,42:l-43.

[5] 李雪雁,李照會,許維岸.蘇云金芽孢桿菌cry基因研究進展[J].昆蟲知識,2003,40(1):9-13.

[6] MIZUKI E,OHBA M, AKAO T, et al. Unique activity associated with non-insecticidal Bacillus thuringiensis parasporal inclusion:in vitro cell-killing action cancer cells[J]. J Appl Microbiol,1999,86:477-486.

[7] 劉冰花,周紅,張定玲.蘇云金芽胞桿菌的研究進展[J].成都大學學報(自然科學版),2007,26(1):9-13.

[8] ARONSON A I, SHAI Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: Unique features of their mode of action[J]. FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):1-8.

[9] KRONSTAD J W, SCHNEPF H E, WHITELEY H R. Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes[J]. J Bacteriol, 1983,154(1):419-428.

[10] WHITELEY H R, SCHNEPF H E. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis[J]. Annu Rev Microbiol,1986,40:549-576.

[11] 唐韻.我國生物農藥登記品種及其使用技術[J].農藥市場信息,2013(7):39-40.

[12] 喻子牛.蘇云金芽胞桿菌[M].北京:科學出版社,1990.

[13] HANSEN B M, HENDRIKSEN N B. Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2001,67(1):185-189.

[14] 袁志明,蔡全信,ANDRUP L,等.蘇云金芽胞桿菌腸毒素基因的PCR檢測[J].微生物學報,2001,41(2):148-154.

[15] VAN DER AUWERA G A,TIMMERY S, MAHILLON J,et al. Plasmid exchanges among members of the Bacillus cereus group in foodstuffs[J]. Int J Food Microbiol,2006,113:164-172.

[16] 黃必旺.蘇云金芽孢桿菌的腸毒素及其安全性研究[D].福州:福建農林大學,2005.

[17] YANG C Y, PANG J C, KAO S S, et al. Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production[J]. J Agric Food Chem, 2003,51(1):100-105.

[18] 胡曉敏.蠟狀芽孢桿菌群菌株病原相關分析及其遺傳改良[D].武漢:中國科學院研究生院(武漢病毒研究所),2007.

[19] 劉坤.蘇云金芽孢桿菌高毒菌株菌種選育和制劑研究[D].合肥:合肥工業大學,2011.

[20] 李桂玲,李明澤,李春奇,等.轉Bt基因玉米研究進展[J].安徽農業科學,2008,36(32):14027-14029.

[21] 王北艷,殷奎德.轉Bt抗蟲基因水稻生物安全性探討[J].江蘇農業科學,2012,40(9):271-273.

[22] 陸宴輝.Bt棉花害蟲綜合治理研究前沿[J].應用昆蟲學報,2012,49(4):809-819.

4.2Bt的遺傳改良

從自然環境中很難直接分離出不含腸毒素基因,且不產生腸毒素溶血活性同時又具有高效殺蟲質粒的Bt菌株。接合轉移是一種新的遺傳改良方式,是通過基因剔除使Bt的病原因子失活或選擇不含腸毒素基因無溶血活性的Bt或Bc宿主菌,導入高效殺蟲質粒進行遺傳改良,從而篩選出一些既無致病危害又保留高效殺蟲毒力的重組菌株。2003年Yang等[17]把Cry1Ac基因轉移到一個沒有溶血活性的庫斯塔克亞種中,結果獲得的新菌株的殺蟲活性與原來的庫斯塔克亞種親本菌株的殺蟲活性幾乎一樣。

經過多年的研究積累,Bt的遺傳改良工作取得了以下成果。

改良出蠟狀芽孢桿菌DBt248,其不含溶血素hbl基因、非溶血素nhe基因、病原調控因子plcR和pXO1-ORF101相似片斷,因而沒有溶血活性,有望作為宿主菌用于蘇云金芽孢桿菌的殺蟲蛋白的表達以構建安全高效的殺蟲工程菌株[18]。

含有殺蟲晶體蛋白基因cry1Ac的高效殺蟲質粒pHT73能以自然接合轉移的方式轉移到兩株庫斯塔克亞種、1株覃狀芽孢桿菌、5株蠟狀芽孢桿菌和1株不含致病因子的達姆斯特變種中。接合子菌株能表達相應的殺蟲晶體蛋白。有試驗證明pHT73質粒在庫斯塔克亞種中的轉移率較高[18]。

將編碼有多種殺蟲毒素基因的大質粒pBtoxis接合轉移至蠟狀芽孢桿菌群菌株間,發現pBtoxis的宿主范圍比pHT73窄,轉移效率也較低,只有10-8接合子/受體,而且必須在接合輔助質粒的幫助下發生轉移。pBtoxis能在芽孢形成期表達多種毒素蛋白[18]。

將無腸毒素基因不產生無腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌導入pBtoxis質粒或pHT73質粒后,接合子也無溶血性。研究表明,用無腸毒素基因不產生無腸毒素活性的蠟狀芽孢桿菌作為宿主菌,以接合轉移的方式構建安全的Bt工程菌的設想是可行的[18]。

plcR基因是一種調控基因,能調控溶血素基因、腸毒素基因等基因的活性。用插入失活的方式破壞plcR基因可以使以色列亞種AND672的溶血活性降低。plcR基因的失活不影響殺蟲蛋白基因的表達,也不影響其殺蟲活性[18]。

以HD-1為初始誘變株經紫外線、亞硝基胍、N+離子等注入誘變,篩選出5株對棉鈴蟲有高毒力的誘變株,B47、B28、S159、B209和S218,其毒力分別提升87%、140%、87%、92%和100%,傳代10代后其毒力沒有明顯下降[19]。

另外,利用基因工程技術,任何生物體都可以獲得并表達Cry殺蟲晶體蛋白,這也是Bt遺傳改良的又一方向。近30年來,隨著轉Bt基因作物[20-22](轉Bt基因番茄、轉Bt基因煙草、轉Bt基因棉花、轉Bt基因水稻以及轉Bt基因玉米等)的不斷問世,Bt在生物防治方面的推廣速度和效果使農林業的發展進入了新的產業化階段。

以上成果說明,將現代分子生物學技術應用于Bt菌株的遺傳改良,可以很好地提高其殺蟲活性和安全性。

參考文獻:

[1] SCHNEPF E, CRICKMORE N, VAN RIE J. Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal proteins[J]. Microbiol Mol Biol Rev, 1998,62(3):775-806.

[2] 蔡啟良,劉子鐸,喻子牛.蘇云金芽胞桿菌生物活性成分研究進展[J].應用與環境生物學報,2003,9(2):207-212.

[3] 李雪,馬玉超,李煦,等.蘇云金芽胞桿菌伴孢晶體的研究進展[J].安徽農業科學,2012,40(1):5920-5924.

[4] KUMAR P A, SHARMA R P, MALIK V S. The insecticidal protein of Bacillus thuringiensis[J]. Adv Appl Microbiol, 1996,42:l-43.

[5] 李雪雁,李照會,許維岸.蘇云金芽孢桿菌cry基因研究進展[J].昆蟲知識,2003,40(1):9-13.

[6] MIZUKI E,OHBA M, AKAO T, et al. Unique activity associated with non-insecticidal Bacillus thuringiensis parasporal inclusion:in vitro cell-killing action cancer cells[J]. J Appl Microbiol,1999,86:477-486.

[7] 劉冰花,周紅,張定玲.蘇云金芽胞桿菌的研究進展[J].成都大學學報(自然科學版),2007,26(1):9-13.

[8] ARONSON A I, SHAI Y. Why Bacillus thuringiensis insecticidal toxins are so effective: Unique features of their mode of action[J]. FEMS Microbiol Lett,2001,195(1):1-8.

[9] KRONSTAD J W, SCHNEPF H E, WHITELEY H R. Diversity of locations for Bacillus thuringiensis crystal protein genes[J]. J Bacteriol, 1983,154(1):419-428.

[10] WHITELEY H R, SCHNEPF H E. The molecular biology of parasporal crystal body formation in Bacillus thuringiensis[J]. Annu Rev Microbiol,1986,40:549-576.

[11] 唐韻.我國生物農藥登記品種及其使用技術[J].農藥市場信息,2013(7):39-40.

[12] 喻子牛.蘇云金芽胞桿菌[M].北京:科學出版社,1990.

[13] HANSEN B M, HENDRIKSEN N B. Detection of enterotoxic Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis strains by PCR analysis[J]. Appl Environ Microbiol, 2001,67(1):185-189.

[14] 袁志明,蔡全信,ANDRUP L,等.蘇云金芽胞桿菌腸毒素基因的PCR檢測[J].微生物學報,2001,41(2):148-154.

[15] VAN DER AUWERA G A,TIMMERY S, MAHILLON J,et al. Plasmid exchanges among members of the Bacillus cereus group in foodstuffs[J]. Int J Food Microbiol,2006,113:164-172.

[16] 黃必旺.蘇云金芽孢桿菌的腸毒素及其安全性研究[D].福州:福建農林大學,2005.

[17] YANG C Y, PANG J C, KAO S S, et al. Enterotoxigenicity and cytotoxicity of Bacillus thuringiensis strains and development of a process for Cry1Ac production[J]. J Agric Food Chem, 2003,51(1):100-105.

[18] 胡曉敏.蠟狀芽孢桿菌群菌株病原相關分析及其遺傳改良[D].武漢:中國科學院研究生院(武漢病毒研究所),2007.

[19] 劉坤.蘇云金芽孢桿菌高毒菌株菌種選育和制劑研究[D].合肥:合肥工業大學,2011.

[20] 李桂玲,李明澤,李春奇,等.轉Bt基因玉米研究進展[J].安徽農業科學,2008,36(32):14027-14029.

[21] 王北艷,殷奎德.轉Bt抗蟲基因水稻生物安全性探討[J].江蘇農業科學,2012,40(9):271-273.

[22] 陸宴輝.Bt棉花害蟲綜合治理研究前沿[J].應用昆蟲學報,2012,49(4):809-819.