干旱脅迫下NO對大豆幼苗抗氧化酶活性的影響

王華華+楊麗丹+黃俊駿

摘要:以大豆為試驗材料,研究了干旱脅迫下NO對抗氧化酶活性的調節作用。結果顯示,干旱脅迫處理顯著地增強了大豆根中NO產生和抗氧化酶SOD、CAT和POD活性;外源NO處理進一步增加了抗氧化酶活性,而NO清除劑處理則抑制了NO產生和抗氧化酶活性;NO合成酶(NOS)抑制劑和硝酸還原酶(NR)抑制劑處理均明顯抑制了干旱脅迫下NO產生和抗氧化酶活性,且NOS抑制劑影響程度更大。此外,干旱脅迫增強了NOS和NR活性,而且NOS活性增幅比NR大。這些結果表明,干旱脅迫下NOS和NR途徑介導的NO產生參與了大豆根中抗氧化酶活性的調節,而且NOS途徑起著主要作用。

關鍵詞:大豆;干旱脅迫;一氧化氮(NO);抗氧化酶

中圖分類號:S565.1;Q945.78文獻標識碼:A文章編號:0439-8114(2014)11-2493-04

Effects of NO on the Activity of Antioxidative Enzymes in Soybean Seedlings

under Drought Stress

WANG Hua-hua, YANG Li-dan, HUANG Jun-jun

(College of Life Science, Henan Normal University, Xinxiang 453007, Henan, China)

Abstract: Soybean was used to investigate the regulatory role of NO on the activity of antioxidative enzymes in soybean seedlings under drought stress. The results showed that NO production and activities of SOD, CAT and POD were significantly increased in the soybean roots exposed to drought stress. Application of exogenous NO to soybean seedlings further increased the activity of antioxidative enzymes, while NO scavenger inhibited NO production and the activity of antioxidative enzymes. Both inhibitors of NO synthase (NOS) and nitrate reductase (NR) significantly inhibited NO production and the activity of antioxidative enzymes under drought stress, and NOS inhibitor had greater effect than NR inhibitor had.The activities of NOS and NR were increased under drought stress, and NOS activity was more than NR activity. The results indicated that both NOS and NR mediated NO production was involved in regulating the activity of antioxidative enzymes under drought stress. NOS pathway played a dominant role in this process.

Key words: soybean; drought sress; nitric oxide(NO); antioxidative enzymes

基金項目:國家自然科學基金項目(U1204305);河南省教育廳科學技術研究重點項目(13A180515);河南省基礎與前沿技術研究項目(132300410455)

干旱是影響世界上許多地區農業生產的最主要環境因子之一。研究表明,全世界由于干旱造成的作物減產超過了其他逆境因子危害的總和[1]。干旱脅迫可以導致活性氧的過量積累,使得細胞內自由基的代謝平衡遭到破壞,引發或加劇膜脂過氧化作用,造成細胞膜系統的損傷。植物在長期的適應過程中,形成了一整套清除活性氧的抗氧化酶防御體系,包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)等,這些酶已廣泛用于植物抗逆境反應機理的研究[2]。目前在小麥[3]、大豆[4]、花生[5]等方面的研究工作均證明抗氧化酶活性與植物抗旱性有著密切的關系。然而,對于干旱脅迫下抗氧化酶活性的調節機制報道很少。

一氧化氮(NO)是生物體中重要的氧化還原信號分子,在植物體內的酶促途徑主要是通過硝酸還原酶(NR)和一氧化氮合成酶(NOS)催化合成[6]。大量的研究表明,NO參與了植物生長發育和環境脅迫響應過程,如種子萌發、根生長、細胞凋亡、防御相關基因的表達以及植物的耐逆反應等[7,8]。近些年來,NO對植物抗逆性調節作用的研究已經受到了廣泛的重視。在小麥[3]、刺槐[9]、枳[10]等植物中的證據表明,施用外源NO可緩解干旱脅迫對植物造成的傷害,其原因與NO增強的抗氧化酶活性密切相關。但是,對于干旱脅迫下內源NO是否參與了植物抗氧化酶活性的調節目前還不清楚。

目前對于干旱脅迫下NO與抗氧化酶關系的研究多集中于外源NO對抗氧化酶系活性的影響,很少探討干旱脅迫下內源NO對調節抗氧化酶系的作用。本研究以大豆為試驗材料,利用NO清除劑、NO產生途徑相關抑制劑處理,探討了干旱脅迫下內源NO在調節抗氧化酶中的作用以及干旱脅迫下NO的產生來源,以期為大豆抗旱機理的研究和選育抗旱品種提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試材料

供試大豆(Glycine max)品種為河南省大面積種植的豫豆19(種子由河南省農業科學院提供)。

1.2材料培養

挑選大小一致的大豆種子,用5%次氯酸鈉消毒15 min后,用自來水反復沖洗干凈,放入水中浸泡3 h使種子充分吸脹,然后將種子于恒溫箱內25 ℃黑暗條件下萌發2 d。挑選萌發一致的大豆種子,將其種在放有蛭石的托盤里,并用1/4 Hoagland溶液澆灌。培養條件:25 ℃,14 h光周期,相對濕度控制在70%。

1.3材料處理

以聚乙二醇(PEG)6000模擬干旱脅迫處理。將生長3 d的幼苗取出洗凈后轉移到盛有10% PEG、 100 μmol/L 硝普鈉(SNP)、200 μmol/L N-硝基-L-精氨酸(L-NNA)、20 μmol/L疊氮化鈉(NaN3)和200 μmol/L 2-苯基-4,4,5,5-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(PTIO)溶液的塑料容器中進行不同處理。處理24 h后收集大豆主根用于各項指標的測定。

1.4測定方法

相對電導率采用DDS-307A型電導率儀測定,參照Wang等[11]的方法;丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[11];超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑(NBT)光氧化還原法[12],SOD活性以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位;過氧化氫酶(CAT)活性測定參照Wang等[12]的方法,CAT活性以消耗1 μmol(H2O2)/min為一個酶活性單位;過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創木酚法[12],以每分鐘A470 nm變化0.01為1個酶活性單位。NO含量通過氧合血紅蛋白向高鐵血紅蛋白轉化的量來計算,參照Murphy等[13]的方法;NOS和NR活性測定參照Tian等[14]的方法。所測指標均選用大豆的主根為試驗材料,3次重復,取平均值。

2結果與分析

2.1干旱脅迫對大豆幼苗相對電導率和MDA含量的影響

相對電導率和MDA含量是反映植物細胞遭受傷害程度的常用指標。由圖1可知,5% PEG處理大豆1 d,根中相對電導率和MDA含量略微增加;隨著PEG用量的增加,相對電導率和MDA含量表現出顯著增加的趨勢。從形態上看,15% PEG處理時,植株表現出明顯的萎蔫現象;20%PEG處理時則表現出非常嚴重的萎蔫。表明輕度脅迫(5% PEG)對大豆相對電導率和MDA含量影響較小,重度脅迫(>15% PEG)對其影響則較大。根據以上試驗結果,后續試驗選定中等脅迫程度(10% PEG)進行干旱脅迫處理。

2.2干旱脅迫下NO對大豆幼苗抗氧化酶活性的影響

如表1所示,PEG處理顯著增加了大豆根中SOD、CAT和POD的活性,比對照分別增加了59.7%、91.5%和75.9%。SNP(NO供體)處理則進一步增加了干旱脅迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性,分別比PEG處理增加了15.2%、27.9%和33.3%。結果表明,外源NO可增加干旱脅迫誘導的抗氧化酶活性。PTIO(NO清除劑)處理則抑制了干旱脅迫誘導的抗氧化酶活性,表現出與對照相近的水平,表明內源NO參與了干旱脅迫誘導的抗氧化酶活性的調節。L-NNA(NOS抑制劑)處理顯著地抑制了干旱脅迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性;NaN3(NR抑制劑)處理也抑制了干旱脅迫下大豆根中SOD、CAT和POD活性。這些結果表明,NOS和NR介導的NO產生途徑均參與了干旱脅迫下抗氧化酶活性的調節,并且NOS途徑起著主導作用。

2.3干旱脅迫對大豆幼苗NO產生的影響

為了進一步證實NO參與調節了干旱脅迫下抗氧化酶活性的誘導,本試驗檢測了干旱脅迫下NO的產生情況。如圖2所示,干旱脅迫下大豆根中NO產生情況與抗氧化酶活性變化趨勢一致。PEG處理增加了NO的產生,與對照相比增加了89.3%;PTIO處理則完全抑制了干旱脅迫誘導的NO產生;L-NNA和NaN3處理均抑制了干旱脅迫下NO產生,與PEG處理相比均顯著降低。這些結果進一步表明,干旱脅迫下NO參與了抗氧化酶活性的調節。

2.4干旱脅迫對大豆幼苗NOS和NR活性的影響

為了進一步弄清干旱脅迫下NO產生的來源,本試驗檢測了干旱脅迫下NOS和NR活性的變化。如圖3所示,干旱脅迫下大豆根中NOS和NR活性變化趨勢與NO產生趨勢一致。PEG處理顯著增加了NOS和NR活性,且NOS比NR增加的幅度大。結果表明,干旱脅迫下NO來源于NOS和NR兩條途徑,但是主要來源于NOS途徑。

3討論

逆境脅迫下,植物體內會產生大量的活性氧,對植物造成氧化傷害[10,15]。然而,植物在遭受逆境時,其體內也會產生相應的活性氧清除機制。研究表明,SOD、CAT和POD是幾種重要的抗氧化酶,在清除活性氧保護植物避免遭受活性氧誘導的氧化傷害中發揮著重要的作用[16]。現已在小麥[3]、大豆[4]、刺槐[9]、枳[10]等多種植物中發現干旱脅迫誘導的抗氧化酶活性的增加與植物的抗旱性有關。但有關抗氧化酶系統與植物抗旱性關系的研究結果也不盡相同[2,17],這可能與植物的種類、脅迫程度、抗氧化酶系統活性大小等因子的不同都有關系。本試驗結果表明,干旱脅迫處理增強了大豆根中SOD、CAT和POD活性,說明大豆根中也存在著類似的活性氧清除的機制,這與莫紅等[2]在干旱脅迫下大豆葉片抗氧化酶活性的研究中得到的結論是一致的。

然而,目前對于干旱脅迫下抗氧化酶活性的調節機制仍不清楚。大量證據表明,NO參與了植物多種非生物脅迫響應,包括鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫、UV-B輻射等,并能增強植物對逆境的耐受性[10,18-20]。有證據表明,干旱脅迫下施用外源NO可增強抗氧化酶活性并緩解干旱脅迫對植物造成的傷害[3,10]。本試驗結果也進一步證實了外源NO可增強大豆根中抗氧化酶活性。這些研究結果表明NO可能參與了干旱脅迫條件下大豆中抗氧化酶活性的調節,但是以前的研究都是集中在探討外源NO對抗氧化酶活性的影響,很少有探討干旱脅迫下內源NO是否參與了大豆抗氧化酶活性調節的報道。

本試驗結果表明,干旱脅迫處理增加了大豆根中NO的產生,當干旱脅迫誘導的NO被抑制或被清除時,干旱脅迫誘導的抗氧化酶活性也被抑制,表現出與NO產生呈正相關的關系,表明NO參與了干旱脅迫下抗氧化酶活性的調節。為了弄清干旱脅迫下內源NO產生途徑,本試驗中運用了NOS和NR抑制劑。結果表明,NOS和NR抑制劑處理均抑制了干旱脅迫下NO的產生,并且NOS抑制劑處理比NR抑制劑處理抑制程度更大,表明干旱脅迫下NOS途徑和NR途徑干旱脅迫下均能產生NO,而且NOS途徑對NO產生的貢獻更大。為了進一步證實這個結論,本試驗檢測了干旱脅迫下NOS和NR活性。結果表明,干旱脅迫增加了NOS和NR活性,并且NOS活性的增幅比NR活性的增幅大,表明干旱脅迫下NOS途徑對NO的產生確實起著主要作用。以前有研究報道,NOS介導的NO產生參與了擬南芥中鹽脅迫響應[21],而在紅蕓豆中發現NR介導的NO參與了鹽脅迫響應[19]。此外,干旱脅迫條件下NOS介導的NO產生參與了枳中干旱脅迫響應[10]。這些研究結果表明,植物中NOS途徑或NR途徑對NO產生貢獻的大小可能取決于植物種類和環境脅迫的種類。

綜上所述,本試驗結果表明,干旱脅迫刺激了大豆根中NOS和NR活性的增加,從而增強了NO產生;增強的NO使干旱脅迫下抗氧化酶活性增強,使得植物體內避免活性氧的過量累積而對植物細胞造成氧化傷害,從而增強植物的抗旱性。但對于干旱脅迫下NO對抗氧化酶活性的調節機制還需要進一步研究。

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