白藜蘆醇預防性給藥對胃癌大鼠血清PG及相關細胞因子水平的影響

吳異蘭 鄭國華 龐書勤，李綿利，張琪

(福建中醫藥大學護理學院, 福建 福州 350122) (福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122) (福建中醫藥大學護理學院, 福建 福州 350122)

白藜蘆醇(resveratrol，Res)，化學名稱為反式-3,4,5-三羥基-1,2-二苯乙烯(亦稱芪三酚)，是葡萄屬植物產生的一種植物抗毒素。白藜蘆醇的生物活性作用不但包括抗氧化、抗炎、抗病毒、抑制血小板聚集、調節血脂，而且還具有一定的抗腫瘤作用[1-4]。課題組對白藜蘆醇的前期體外研究發現其能夠抑制胃癌細胞株的增殖并誘導凋亡[5-6]；前期體內研究通過對N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)等多因素染毒大鼠的死亡率、腫瘤發生率及胃體解剖組織學等指標的觀察和分析，發現白藜蘆醇還可有效提高大鼠對MNNG 等誘癌因素的耐受能力, 具有一定的預防作用[7]。在此基礎上，觀察白藜蘆醇預防性給藥對胃癌大鼠血清PG及相關細胞因子水平的影響，探討其預防作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥品

雄性Wistar大鼠(上海斯萊克實驗動物有限責任公司，質量許可證號：SCXK滬2007-0005)的飼養在福建中醫藥研究院動物實驗中心進行。白藜蘆醇購自西安賽德公司(98%，HPLC)。MNNG(5g/瓶,日本TCI)實驗前用甲醇助溶后用去離子水配成1g/L的儲備液(每周一配)，4℃冰箱保存并避光，每天臨用時稀釋為100mg/L。大鼠胃蛋白酶原(pepsinogens，PG)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、缺氧誘導因子-1 (hypoxia inducible factor-1, HIF-1)酶聯免疫檢測試劑盒均購自美國R&D.

1.2 動物分組、染毒及給藥方法

雄性Wistar大鼠95只，體質量90～100g，4周齡。隨機數字表法分為5組：其中模型組25只以MNNG染毒，具體染毒方法、動物分組及給藥方法同文獻[7]；空白對照組10只普通飼料喂養；白藜蘆醇低劑量組(50mg/kg)、中劑量組(100mg/kg)和高劑量組(150mg/kg)各20只，染毒方法同模型組，選用在高鹽飼料基礎上加入不同劑量白藜蘆醇配成的低、中、高濃度白藜蘆醇飼料進行喂養，自由進食。30周后模型組和白藜蘆醇各用藥組均改為空白對照組喂養方式至38周實驗結束。

1.3 大鼠血清PG及TNF-α、HIF-1水平檢測

采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測大鼠血清PG及TNF-α、HIF-1水平。實驗結束前大鼠禁水12h、禁食24h。乙醚麻醉后剖腹，采腹動脈血，離心取血清。按照ELISA試劑盒說明書進行操作。分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、標準品孔和待測樣品孔。標準品孔和樣品孔首先分別加入稀釋好的標準品和樣品(離心后的血清)，37℃反應30min。棄去液體，充分洗滌5次后加入酶標試劑，37℃反應30min。棄去液體，充分洗滌5次后加入顯色液A、B，37℃顯色10min后加入終止液。15min內在酶標儀波長450nm處測出OD值。所有OD值減除空白值后進行計算，以不同濃度的標準品OD值作出標準曲線，據每個待測樣本的OD值在標準曲線上查得樣品PG及TNF-α、HIF-1濃度。

1.4 統計學分析

所有數據用SPSS 13.0統計軟件進行處理，多組間均數比較采用單因素方差分析后用SNK-q檢驗進行兩兩比較。P<0.05表明差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清PG水平

ELISA檢測大鼠血清PG水平的結果見圖1。

圖1 ELISA檢測大鼠血清PG水平結果

2.2 各組大鼠血清TNF-α水平

ELISA檢測大鼠血清TNF-α水平的結果見圖2。

圖2 ELISA檢測大鼠血清TNF水平結果

2.3 各組大鼠血清HIF-1水平

ELISA檢測大鼠血清HIF-1水平的結果見圖3。

圖3 ELISA檢測大鼠血清HIF-1水平結果

3 討論

PG是胃蛋白酶的前體，分為PGI、PGⅡ兩個亞群。大部分酶原進入胃腔，經酸解成具有活性的胃蛋白酶發揮其消化蛋白質的作用。但也有少量透過胃黏膜毛細血管進入血液，故PG可從血清中檢測。血清PG水平是反映胃黏膜形態和功能的良好指標。當胃粘膜發生病變時，血清中PG的含量也隨之發生改變。PG作為一種新的腫瘤標志物，對于胃癌的早期診斷和篩選，以及胃癌術后復發與轉移的檢測都有重要的意義[8]。且幽門螺桿菌抗體與PG的濃度有很強的關聯性[9]。本研究中ELISA結果提示模型組大鼠血清PG值明顯低于空白對照組，而白藜蘆醇的預防用藥組的PG值與模型組相比有明顯增高，并有一定的濃度依賴性，提示了白藜蘆醇對胃部腫瘤的預防作用可能與其抗幽門螺桿菌的相關機制有所類似，有待進一步驗證。

TNF-α主要由活化的單核一巨噬細胞產生，NK細胞、T細胞、B細胞、內皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質細胞、平滑肌細胞、星型細胞、成骨細胞等亦可產生。本研究ELISA結果顯示，白藜蘆醇給藥組與模型組比較TNF-α值明顯上升，提示白藜蘆醇可能通過調節炎癥因子TNF-α抑制p38 MAPK、NF-ΚB這兩條炎癥通路達到抗炎效果[10]。

由于腫瘤細胞生長迅速，腫瘤的部分細胞處于缺氧甚至無氧狀態。HIF-1在細胞適應缺氧環境的各條信號傳導通路中起到了核心作用，它可以促進腫瘤細胞在缺氧條件下的生長、遷移。本實驗中，白藜蘆醇給藥組與模型組比較HIF-1值明顯下降，并呈現一定的濃度依賴性，提示白藜蘆醇具有抑制HIF-1的作用，白藜蘆醇可能在HIF-1mRNA轉錄后通過各種信號通路增強其降解，阻礙其蛋白翻譯。另有研究表明白藜蘆醇可能通過對抗LPA(1ysophosphatidic acid)缺氧條件下引起的HIF-1和VEGF水平升高，從而抑制了LPA相關的腫瘤侵襲和轉移[11]。自藜蘆醇還可能通過多種機制抑制乳腺癌細胞的糖代謝，這種抑制作用與HIF-1被抑制的表象一致[12]。這些結果提示我們可以考慮以HIF-1為靶點對白藜蘆醇對腫瘤的預防作用機制進行進一步的探討。

[參考文獻]

[1]Guerrero RF, Garcia-Parrilla MC, Puertas B, et al. Wine, resveratrol and health:a review[J]. Nat Prod Commun，2009, 4(5):635-658.

[2]Boscolo P, Del Signore A, Sabbioni E, et al. Effects of resveratrol on lymphocyte proliferation and cytokine release[J]. Ann Clin Lab Sci, 2003, 33(2):226-231.

[3]Athar M, Back JH, Kopelovich L, et al. Multipe molecular targets of resveratrol:Anti-carcinogenic mechanisms[J]. Arch Biochem Biophys,2009, 486(2):95-102.

[4]Kundu JK, Surh YJ. Cancer chemopreventive and therapeutic potential of resveratrol:mechanistic perspectives[J]. Cancer Lett,2008, 269(2):243-261.

[5]鄭國華, 李會慶. 大蒜油和白藜蘆醇聯合應用對胃癌細胞抑制作用及其機制[J]. 福建中醫學院學報,2006, 16(6):34-36.

[6]鄭國華, 李顥, 李會慶. 大蒜油和白藜蘆醇聯合應用誘導胃癌細胞凋亡[J]. 中國公共衛生,2005, 2l(l0):1205-1207.

[7]鄭國華,諶海英,吳華嵩.白藜蘆醇對MNNG等多因素誘導大鼠胃部腫瘤的預防作用[J].中國自然醫學雜志,2010,12(5):321-323.

[8]金妮，沈銘昌. 胃蛋白酶原在胃癌及癌前病變組織中的表達[J].中華病理學雜志，1991,20(2):84-86.

[9]Kikuchi S, Kurosawa M, Sakiyama T, et al. Long-term effert of Helicobacter pylori infection on serum pepsinogens[J]. Jpn J Cancer Res, 2000,9(5):471-476.

[10]Manna SK, Mukhopadhyay A, Aggarwal BB1 Resveratrol suppress TNF-2 induced activation of unclear transcription factors NF-Κb, activator protein-1 and apoptosis:potential role of reactive oxygen intermediates and lipid peroxidation [J]. Immunol, 2001,164(11):6509.

[11]Park SY，Jeong KJ，Lee J，et al.Hypoxia enhances LPA-induced HIF-1alpha and VEGF expression: their inhibition by resveratrol[J].Cancer Lett，2007，258：63-69.

[12] Kueck A，Opipari AW，Gdth KA，et al.Resveratrol inhibits glucose metabolism in human ovarian cancer cells[J].Gynecol Onco，2007, 107：450-457.