兩種人胚胎干細胞體外誘導CD34+造血前體細胞方法的比較

董曉雅 潘光錦 劉加軍

30多年前小鼠胚胎干細胞的發現開啟了人類對于多能干細胞研究的新篇章[1］。至1998年，人胚胎干細胞（hESCs）的發現則為人類再生醫學的發展帶來了新的希望。目前，我們已能在體外培養由未著床的胚胎內細胞團分離的hESCs，并使其長期維持在未分化的狀態。CD34+造血前體細胞在血液病的臨床和基礎研究中具有潛在的優勢。首先，血液系統分級明顯，所有血液前體細胞及各類型成熟血液細胞均可由造血干細胞分化發育而來，而對各類細胞我們已有一定程度的了解。其次，體外建立hESCs向造血前體細胞分化的模型有助于我們研究造血早期發育的過程，而此前由于該過程開始于胚胎發育第一周，受條件所限我們很難詳細研究。第三，高效的體外誘導分化體系的建立將有助于研究各類血液系統疾病的發生與發展，而誘導得到的造血前體細胞將有可能最終應用于臨床造血干細胞的移植[2］。經由hESCs模擬的體外誘導造血發育已先后在多個體系中實現，主要方法包括形成擬胚體的方法，與各類基質細胞系共培養的方法，以及二維單層誘導的方法[3-5］。每種方法均各有特點，鑒于此，我們利用實驗室現有資源，對比hESCs/OP9共培養方法和二維單層誘導方法在誘導效率上的差異，以期為后續的早期造血發育研究打好基礎。

材料與方法

一、細胞系及主要試劑

hESCs系H1、小鼠骨髓基質細胞系OP9、人胚胎干細胞完全培養基、胚胎干細胞基質膠、胎牛血清、重組人骨形態發生蛋白-4及重組人堿性成纖維細胞生長因子均由中國醫學科學院廣州健康研究院提供。

二、方 法

1.H1的傳代培養方法

選用hESCs完全培養基mTeSR1做常規培養，H1細胞經乙二胺四乙酸（EDTA）處理后，以1∶3～4的比例接種于hESCs基質膠Matrigel（MG）包被的6孔板中，置于5% 二氧化碳、37℃培養箱中培養，每日換液，4 d傳一代，將細胞維持在未分化狀態[6］。

2.OP9的傳代培養方法

用含20%胎牛血清的Alpha-MEM培養液常規培養，OP2細胞用0.25%胰酶消化后，以1∶5的比例接種于0.1% 明膠包被的10 cm盤中，置于5% 二氧化碳、37℃培養箱中培養，4 d傳一代，傳代間期不換液[7］。

3.hESCs/OP9共培養方法

將未分化的H1在MG包被的6孔板中培養3～4 d，每孔細胞密度達80%，經0.02 g/L分散酶（dispase）處理后，用1 ml槍頭輕緩刮散成碎片，加至培養OP9細胞的10 cm盤中，10 cm盤中H1細胞計數約為5×106，培養基為Alpha-MEM加上10%胎牛血清、100μM 硫代甘油。將10 cm盤放至37℃培養箱中培養9 d，并在第4、6、8日半量換液[7］。H1與OP9細胞共培養體系的模式圖見圖1。在培養過程中應注意OP9細胞密度，防止細胞出現脂肪化。

圖1 H1與OP9細胞共培養體系模式圖

4.H1的二維單層誘導分化方法

將未分化的H1細胞按照上述普通傳代方法經EDTA處理后，按照1∶4比例接種到MG包被的6孔板中，并于傳代第二日細胞貼壁后更換含有細胞因子的分化培養基，培養基為IMDM培養基，同時添加胰島素-轉鐵蛋白-硒添加劑（100×）、硫代甘油（450 mM）、非必需氨基酸（0.1 mM）、左旋谷氨酰胺 （2 mM），重組人骨形態發生蛋白-4（BMP4，50μg/L），重組人血管內皮生長因子（VEGF，50μg/L），重組人堿性成纖維細胞生長因子（bFGF，50μg/L）。隔日半量換液[5］。H1二維單層誘導分化模式圖見圖2。

5.流式細胞儀檢測

取hESCs/OP9共培養分化后第9日和二維單層誘導分化后第6日的細胞，經0.25%胰酶處理后，置15 ml離心管，300×g離心5 min，用流式緩沖液沖洗2遍后，再次離心棄上清液，用1 ml流式緩沖液重懸，70μm濾網過濾，取細胞懸液100μl，加2μl抗人PE-CyTM5-CD34熒光標記抗體，設陰性對照，加入2μl小鼠PE-CyTM5-IgG1κ同型對照抗體。4℃作用30 min，加2 ml流式緩沖液混勻，300×g離心5 min，棄上清液，用200μl流式緩沖液重懸后置4℃，待機檢測兩類方法體外誘導分化CD34+細胞比例。

圖2 H1二維單層誘導分化模式圖

三、統計學處理

結 果

一、hESCs/OP9共培養誘導分化情況

鏡下觀察傳代培養的H1細胞貼壁生長，呈未分化狀態，單個克隆內細胞排列緊密，視野內無分化細胞，見圖3A。OP9細胞傳代后亦為貼壁生長，細胞纖長，見圖3B。圖3C所示為H1細胞貼壁，共培養第1日的細胞形態，由圖示可知，此時H1仍處于未分化狀態。隨著分化過程的進展，在第3～4日，貼壁的H1細胞克隆內逐漸出現分化形態的細胞。而至共培養第9日，如圖3D所示，即出現典型放射狀囊樣結構，出現CD34+細胞。將此時的細胞經胰酶處理后，用流式細胞儀檢測CD34+細胞的百分率。

圖3 hESCs/OP9共培養誘導分化細胞圖

二、H1的二維單層誘導分化

如圖4A為傳代后貼壁的H1，為典型未分化狀態，后更換分化培養基，如圖4B在誘導分化第2日H1即出現分化現象，分化第6日，如圖4C，細胞密度顯著增加且分化明顯，產生CD34+細胞。此時將細胞用胰酶處理后，同樣用流式細胞儀檢測分化細胞中CD34+細胞比例。

圖4 二維單層誘導分化細胞圖

三、hESCs/OP9共培養方法和二維單層誘導方法得到CD34+細胞的百分率比較

hESCs/OP9共培養方法第9日，CD34+細胞的比例可達（19.7±7.9）%；二維單層誘導方法盡管誘導時間較短，但CD34+細胞的比例僅為（5.8±1.8）%。hESCs/OP9共培養方法誘導效率明顯高于二維單層誘導方法（實驗獨立重復8次，t=3.598，df=7，P=0.009）。見圖5。

討 論

圖5 hESCs/OP9共培養和二維單層誘導方法誘導得到CD34+細胞百分率的流式細胞術圖

目前，臨床上應用最廣泛也最成熟的細胞替代治療方法即造血干細胞的移植。移植細胞的來源主要包括骨髓、動員的外周血以及臍帶血干細胞，但此3類細胞在臨床應用中均受到數量和質量上的雙重限制。盡管越來越多的研究表明，成體造血干細胞可通過體外增殖來滿足數量的需求，但是經體外培養的造血干細胞在體內造血重建的能力仍受到質疑。而hESCs則具備體外無限增殖的能力，且能體外誘導分化為各級血液細胞，包括造血干/祖細胞，前體細胞以及各類成熟細胞。且通過不斷完善的體外誘導體系，hESCs將有可能滿足臨床造血干細胞移植的標準，并促使我們加深對人類早期造血發育機制以及各類血液疾病發生發展的認識。

我們的實驗涉及了兩類具有代表性的誘導體系，其一為將hESCs與骨髓基質細胞系共培養進行體外誘導分化。作為共培養體系，除在本實驗中涉及的骨髓基質細胞系OP9外，研究人員曾嘗試過多種不同類型，不同來源的基質細胞，如小鼠骨髓基質細胞系S17、小鼠卵黃囊細胞系C166、人胎肝細胞系FH-B-hTERT等[8-10］。但目前應用最為廣泛的仍是OP9細胞系，在過去的大量實驗研究中，OP9共培養體系曾被用于體外誘導獲得血液系統各系前體細胞以及成熟的血液細胞，如淋巴細胞以及巨核細胞[11］。此外，OP9共培養體系還有一個非常重要的優勢，即它可以在不添加大量細胞因子的情況下相對高效地誘導hESCs向造血分化，節省了實驗成本。另有研究人員曾嘗試將擬胚體體外誘導與OP9共培養體系結合，進行造血分化，同樣取得了比較好的結果[12］。在本實驗中，相對于二維單層誘導的低誘導效率，OP9共培養體系顯得更加穩定、高效，因此更適合于后續基礎研究的進展。

本實驗涉及的第二類誘導體系為二給單層誘導體系，該體系的優勢在于能夠采用無飼養層無血清且成分完全明確的培養基，在體外直接將人胚胎干細胞誘導為造血前體細胞，這就避免了應用鼠源細胞及異源性血清，進而更容易克服異種問題，有助于未來體外誘導得到的各類血液細胞應用于臨床。但該系統較低的誘導效率以及更高的實驗成本大大限制了其應用及發展。

OP9共培養體系模擬了骨髓造血微環境，從而為hESCs提供了造血分化的條件，而骨髓微環境是極為復雜的，到目前為止，我們還不能完全了解所有參與造血的細胞因子、化學小分子及各類信號通路，單純通過提供幾類細胞因子而達到體外直接高效誘導造血分化是非常困難的。因此，對于后續基礎研究，我們建議以OP9共培養體系為主，深入了解hESCs造血分化的詳細過程及各類調控機制，從而不斷完善包括這兩類誘導體系在內的各類體內、體外造血分化方法，以期在提高誘導效率的同時，也不斷提高誘導質量，來滿足基礎研究和臨床應用的需要。

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