P-選擇素在基因敲除小鼠肺轉移中的作用研究

亓翠玲 李斌 楊揚 葉杰 王麗京 黃韌

P-選擇素是選擇素家族的重要成員，主要在活化的血小板和血管內皮細胞上表達，可以通過與單核細胞、中性粒細胞表面的P-選擇素配體結合，從而介導活化血小板或內皮細胞與中性粒細胞、單核細胞黏附，因而P-選擇素在血栓形成和炎癥中發揮重要作用[1-3］。P-選擇素還可與腫瘤細胞表面的配體結合介導腫瘤細胞與血小板及內皮細胞的黏附，從而促進腫瘤轉移，但P-選擇素對于黑色素瘤肺轉移的作用尚未見報道，本研究利用P-選擇素敲除小鼠觀察P-選擇素對黑色素瘤細胞肺轉移的作用。

材料與方法

一、腫瘤細胞和實驗動物

B16黑色素瘤細胞株購于上海細胞生物研究所，常規培養于含10%小牛血清的RPMI-1640培養液中。P-選擇素敲除的小鼠 （P-sel-/-）購自Jackson lab（小鼠背景為C57），6～8周齡。C57小鼠，購自廣東省醫學實驗動物中心，6～8周齡，在無特定病原體（SPF）條件下飼養。

二、肺轉移模型建立

1.實驗動物分組和建模

P-選擇素敲除雌性小鼠（16只）為實驗組，以C57雌性小鼠（15只）作為對照組。取對數生長期B16F10細胞，經胰酶消化后用無血清培養液重懸收集細胞，用無菌PBS調整細胞密度。用臺盼藍染細胞確定活細胞數在95%以上，于每只小鼠尾靜脈注射1×105個（0.2 ml）細胞。

2.腫瘤轉移觀察

在接種腫瘤細胞的第21天，用斷頸法處死小鼠，分離小鼠的肺組織，在10倍倒置顯微鏡下計數肺表面的轉移結節的數目，只要有黑色轉移灶就算一個轉移結節。

三、HE染色步驟

石蠟組織脫蠟至水，自來水沖洗，蘇木精液染色，流水稍洗去蘇木精液后，1%鹽酸乙醇酸化，稍水洗，促藍液返藍水洗后，用曙紅液染色，脫水后，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察結果。

四、統計學處理

采用SPSS11.0統計軟件和Sigmaplot軟件處理（Mann-Whitney test），比較各組間是否具有顯著性差別。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、小鼠肺轉移情況

P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠尾靜脈注射B16黑色素瘤細胞，在小鼠第21天時處死小鼠，分離肺組織，C57小鼠和P-選擇素敲除小鼠肺表面都有黑色的轉移瘤（見圖1）。P-選擇素敲除小鼠肺表面轉移的腫瘤結節的數目明顯比C57小鼠少，兩者比較差異有統計學意義 （t=4.01，P=0.00015），見圖2。

圖1 小鼠尾靜脈注射B16黑色素瘤細胞第21天小鼠肺轉移腫瘤

圖2 C57小鼠和P-選擇素敲除小鼠肺表面轉移的腫瘤結節數比較

二、HE染色證實小鼠肺組織中有B16細胞的肺轉移灶

P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠肺組織固定包埋后，HE染色發現肺組織中確實有腫瘤轉移灶，見圖3。

討 論

黏附分子是一類能介導細胞間黏附以及細胞與細胞外基質黏附的糖蛋白。選擇素是細胞黏附分子家族成員之一，選擇素家族參與了炎癥發生、淋巴細胞歸巢、凝血以及腫瘤轉移等生理和病理過程。P-選擇素是黏附分子選擇素家族的重要成員。P-選擇素可以表達在活化的血小板和內皮細胞表面，而許多腫瘤細胞表面存在P-選擇素配基[包括P選擇素糖蛋白配體-1（PSGL-1）、sia1vl Lewis X（sLex）等糖基結構的糖蛋白、糖脂等］，如乳腺癌、結直腸癌、肺癌、肝癌、腎臟細胞癌、鱗狀上皮癌等，這些受體可與P-選擇素結合介導腫瘤細胞與血小板及內皮細胞的黏附，從而促進腫瘤細胞轉移[4］。Reyes-Reyes等[5］表明P-選擇素可以通過PI3-K和p38 MAPK通路促進結腸癌的轉移。

圖3 C57小鼠和P-選擇素敲除小鼠肺轉移瘤組織HE染色后的顯微鏡下觀察

利用P-選擇素基因敲除小鼠研究發現，P-選擇素缺失會抑制腫瘤的生長和轉移[6-8］。Iwamura等[9］觀察到P-選擇素在腫瘤中表達增加促進了新生血管形成，而且已經提出細胞表面黏附分子和內皮間的相互作用對于腫瘤的轉移和新生血管形成起了重要作用。利用基因敲除小鼠建立腫瘤研究模型是當今腫瘤學研究的最新趨勢。基因敲除小鼠模型在腫瘤研究上具有其它模型無法比擬的優勢：在不伴有藥物副作用的情況下，基因產物的作用被完全消除，因此可以研究單個基因在動物體內的功能。在P-選擇素敲除小鼠體內P-選擇素的功能完全缺失，因此可以利用此小鼠在體內研究P-選擇素對腫瘤生長和轉移的影響。

本研究將B16F10黑色素瘤細胞通過尾靜脈注射到P-選擇素敲除小鼠和C57小鼠體內，建立肺轉移瘤模型，此模型具有腫瘤發生率高、易建立、均一性好、個體差異小等優點。結果表明P-選擇素敲除小鼠B16F10黑色素瘤細胞的肺轉移結節明顯比C57小鼠少，提示P-選擇素缺失可能抑制了黑色素瘤的肺轉移，但P-選擇素對B16F10細胞肺轉移的作用機制還不明確，需要進一步的探討。若對P-選擇素在腫瘤生長和轉移中的作用進一步探討，可能對于尋找理想的抗腫瘤治療靶點及判斷患者預后具有重要意義。

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