人羊水特異蛋白質(zhì)組學的探討研究

朱斌 陳芳 侯常 黎麗紅 黃素華

羊水對于胎兒的正常發(fā)育至關重要，其生成量和成分與胎兒的發(fā)育、胎盤和羊膜腔的功能密切相關[1］。羊水中蛋白質(zhì)組學研究亦成為近年研究熱點。本研究初步觀察了在羊水中特異表達的蛋白質(zhì)及高表達的蛋白質(zhì)，旨在為妊娠相關疾病的發(fā)生、發(fā)病機制的探索研究提供理論依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

材料與方法

一、試劑及儀器

1.試 劑

主要有：ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit血清高豐度蛋白去除試劑盒、四甲乙二胺（Sigma，美國），固相化pH 4～7、24 cm梯度干膠條、Bradford染液（Bio-Rad，美國），丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、甘氨酸十二烷基磺酸鈉（SDS）、尿素、CHAPs、過硫酸銨、碘乙酰氨、二硫蘇糖醇（Amersham Pharmacia Biotech，瑞典），一氯乙腈（成都貝斯特）。

2.儀 器

包括：IPGphor3等電聚焦儀、EttanDALT垂直電泳槽、Image scanner掃描儀、超聲儀（GE，美國），Autoflex speed？MALDI-TOF質(zhì)譜儀（Bruker Dalton，美國），冷凍離心機（中國科學院武漢科學儀器廠）等。

二、蛋白樣品的制備

選擇3名正常妊娠晚期（37周）孕婦，征得其知情同意后，以羊膜穿刺法采集3份羊水標本，每份5 ml，同時以肘部穿刺取靜脈血標本3份，每份5 ml。所采集的標本分別在4℃、16 000×g離心15 min，取上清，0.4μm過濾后分裝， -70℃保存。離心超濾濃縮樣品，ProteoPrep Blue Albumin and IgG Depletion Kit試劑盒去除血清高豐度蛋白質(zhì)，加入4倍體積丙酮，-20℃沉淀過夜。沉淀所得到的蛋白于4℃、12 000×g離心20 min，棄上清，晾干，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｓ肂radford法定量蛋白質(zhì)濃度。

三、雙向凝膠電泳及圖像分析

將去除高豐度蛋白的蛋白團塊重溶。24 cm干膠條在含100μg蛋白質(zhì)樣本和水化液的460μl混合液中20℃水化10～12 h。將膠條放入等電聚焦盤中加電壓聚焦。第一向等電聚焦電泳 （IEF）后，待膠條平衡，再進行12%的聚丙烯電泳酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，電泳所得的雙向凝膠用雙胺硝酸銀法染色及考馬斯亮藍染色，Imagescanner掃描儀進行透射掃描，獲得的數(shù)字化圖像運用ImageMaster 2D platinum 5.0軟件進行蛋白質(zhì)點的檢測、量化、背景扣除、點的匹配。著重選擇pH4～7，分子量10～55 KDa區(qū)域進行觀察，從羊水中找到僅在羊水中表達的蛋白質(zhì)點及在羊水中表達量高于血清2倍以上的蛋白質(zhì)點，隨機選取重復性和分辨率較高的10個差異蛋白質(zhì)點行基質(zhì)輔助激光解吸/離子化飛行時間質(zhì)譜 （MALDI-TOF/TOFMS）鑒定。

四、MALDI-TOF/TOF-MS分析

選取行MALDI-TOF/TOF-MS分析的蛋白質(zhì)點后行挖點、脫色、還原、烷基化、酶解、樣品回收及脫鹽處理、肽段提取后點靶上機，使用Autoflex speedTMMALDI-TOF-TOF質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。利用flexAnalysis軟件過濾基線峰、識別信號峰。利用Mascot軟件搜索NCBI及Uniprot數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關蛋白質(zhì)，同時查詢其功能，明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

結 果

一、高豐度蛋白去除后雙向凝膠電泳分析結果

在pH 4～7、分子量10～55 KDa的區(qū)域中，羊水及血清的蛋白質(zhì)位點分布大部分相同，血清組的斑點多于羊水組（見圖1A、B）。經(jīng)ImageMaster 2D platinum 5.0軟件分析，羊水中約有（613±29）個蛋白質(zhì)點，血清中約有（785±64）個蛋白質(zhì)點，羊水中特異表達的蛋白點約50個（見圖1C），羊水中表達量高的蛋白點約50個（見圖1D）。

圖1 去除高豐度蛋白后的雙向凝膠電泳分析結果

二、MALDI-TOF/TOF-MS分析結果

隨機選取重復性和分辨率較高的10個濃度差異的蛋白質(zhì)斑點行質(zhì)譜分析鑒定，質(zhì)譜分析結果見圖2及表1。

討 論

羊水作為胎兒生長發(fā)育最為重要的因素之一，在多種妊娠疾病的發(fā)生中有重要作用。蛋白質(zhì)組學是繼人類基因組計劃完成后的新興學科[2］。隨著人類蛋白質(zhì)組學組織（HUPO）的正式成立，蛋白質(zhì)組學蓬勃發(fā)展，滲透到各個學科。近年來，國內(nèi)外均有學者對妊娠婦女血液、羊水進行了蛋白質(zhì)組學的研究，探索新的妊娠蛋白和疾病特異蛋白，以及蛋白質(zhì)在妊娠相關疾病發(fā)生、發(fā)展中的相互作用。然而，目前的多數(shù)研究集中于尋找羊水中特異性的差異蛋白，筆者前期經(jīng)nano LC/MS/MS對羊水的蛋白組學分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)羊水中人62種特異性蛋白[3］。本次通過比較Anderson等[4］和Michel等[5］的結果，新檢測到了22種僅在AF中表達的蛋白，其中14種是分泌型蛋白，其余8種分布于細胞膜、細胞質(zhì)和細胞核。羊水特異性蛋白斑點約50余個，與此前nano LC/MS/MS的結果相符，故本研究不行此類斑點的質(zhì)譜分析。

圖2 3種在羊水和血清中呈濃度差異表達的蛋白質(zhì)

表1 10個在羊水及血清中呈濃度差異表達的蛋白質(zhì)斑點質(zhì)譜分析結果

本研究初步探討在羊水和血清中均有表達，但羊水中表達量明顯要高于血清的一些蛋白質(zhì)。研究初步挑選其中10個重復性和分辨率較高斑點行質(zhì)譜鑒定，檢索UniProt等在線蛋白數(shù)據(jù)庫，除2個斑點為細胞膜及細胞質(zhì)蛋白外，余均為分泌型蛋白質(zhì)。這些蛋白的已知功能如下：硫酸類肝素蛋白多糖（HSPG2）是基底膜的主要成分，對心臟發(fā)育及血管調(diào)節(jié)起著重要作用，此類蛋白質(zhì)缺乏可導致常染色體隱性遺傳病侏儒綜合征的發(fā)生[6］。絨毛膜生成激素（CSH1）具有刺激泌乳、促進胎兒生長及新陳代謝等作用[7］。載脂蛋白AI為雙超螺旋模型的溶液結構B鏈，參與膽固醇的轉(zhuǎn)運，使其從組織中轉(zhuǎn)運至肝臟。因其影響膽固醇代謝，在HDL缺乏癥及淀粉樣變中起著重要的作用，其缺乏可引起早發(fā)冠心病，肝、脾腫大，復發(fā)性周圍神經(jīng)病變，進行性肌肉萎縮和無力，其突變可致淀粉樣多神經(jīng)病腎病、家族性淀粉樣多神經(jīng)病[8-9］。AMBP蛋白是α1微球蛋白前體，具有抑制胰蛋白酶、纖溶酶、粒細胞前溶酶體酶及草酸鈣結晶的作用[10］。另外，胰島素樣生長因子結合蛋白（IGFBP）具有延長胰島素樣生長因子的半衰期，調(diào)節(jié)IGF的促進生長作用[11］。載脂蛋白E與胎兒生長有一定關系[8］。硫氧還原蛋白過氧化物酶2（PRDX2），與細胞氧化還原調(diào)節(jié)有關，在清除新陳代謝過程中產(chǎn)生的過氧化物起著重要的作用，通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)過氧化氫的濃度，誘使生長因子和TNF-α的信息傳導[12］。BPIFA1蛋白與接觸刺激物后引起的氣道炎癥有一定的關聯(lián)，與上呼吸道的天然免疫有一定關系。亦在腫瘤的演化進展起著一定的作用[13］。補體因子B是補體系統(tǒng)的替代途徑，被D因子激活成2個片段Ba、Bb，Bb結合3b因子產(chǎn)生C3或C5轉(zhuǎn)化酶，對B細胞的增殖及分化起著一定作用，Ba的作用與此相反，與溶血性尿毒綜合征非典型4（AHUS4）有關[14］。羊水的某些蛋白質(zhì)表達可反映妊娠生理或病理狀態(tài)，可能有助于妊娠相關疾病如胎兒宮內(nèi)生長受限、子癇前期、早產(chǎn)、宮內(nèi)感染甚至羊水栓塞等的早期診斷。本研究中在羊水表達水平偏高的蛋白質(zhì)是否可提供某種診斷依據(jù)還待進一步研究證明。此外，鑒于本研究僅采用質(zhì)譜蛋白鑒定策略，今后將對羊水中呈差異表達的蛋白質(zhì)采用免疫印跡或其他的方法行進一步驗證，以確定其是完整的蛋白還是片段蛋白。

[1]劉振江，袁正偉，趙群，等.神經(jīng)管缺陷胎兒和神經(jīng)管缺陷胎鼠羊水蛋白質(zhì)標記的比較研究.中華小兒外科雜志，2009，30：777-781.

[2]邱宗蔭.臨床蛋白質(zhì)組學.北京：科學出版社.2008：2-3.

[3]季煜華，曾耀英，周堅，等.應用nanoLC/Ms/MS對人羊水的蛋白質(zhì)組學分析.暨南大學學報：自然科學與醫(yī)學版，2008，29：99-104.

[4]Anderson NL，Polanski M，Pieper P，et al.The human plasma proteome：a nonredundant list dcvdoped by combination of four separate sources.Mol Cell Proteomics，2004，3：311-326.

[5］Michel PE，Crettaz D，Morier P，et a1.Proteome analysis of human plasma and amniotic fluid by Off-Gel isoelectric focusing followed by nano-LC-MS/MS.Electrophoresis，2006，27：1169-1181.

[6]Smith S，Hassell JR.Focus on molecules：perlecan（HSPG2）.Exp Eye Res，2006，83：471-472.

[7］Pérez-Ibave DC，Rodríguez-Sánchez IP，Garza-Rodríguez MD，et al.Extrapituitary growth hormone synthesis in humans.Growth Horm IGF Res，2014，14：19-27.

[8]郭永和，昝朝霞，張維君.冠狀動脈病變程度與血脂成分異常相關性分析.中國循環(huán)雜志，2009，24：101-104.

[9]Delpech M，Valleix S.Amyloid polyneuropathies-biochemical and genetic aspects.Bull Acad Natl Med，2012，196：1309-1318.

[10]Zhang Y，Gao Z，Guo Z，et al.The crystal structure of human proteinα1M reveals a chromophore-binding site and two putative protein-protein interfaces.Biochem Biophys Res Commun，2013，439：346-350.

[11]陸學萍，陸志浩，錢麗娟，等.孕婦血清IGF-1、IGF-2、IGFBP-3水平與正常胎兒生長的相關性.復旦學報：醫(yī)學科學版，2012，39：616-620.

[12]Nagababu E，Mohanty JG，F(xiàn)riedman JS，et al.Role of peroxiredoxin-2 in protecting RBCs from hydrogen peroxide-induced oxidative stress.Free Radic Res，2013，47（3）：164-171.

[13]Liu Y，Bartlett JA，Di ME，et al.SPLUNC1/BPIFA1？contributes to pulmonary host defense against Klebsiella pneumoniae respiratory infection.Am J Pathol，2013，182：1519-1531.

[14]Slade C，Bosco J，Unglik G，et al.Deficiency in？complement factor B.N Engl JMed，2013，369：1667-1669.