馬齒莧多糖對雛雞免疫功能的影響

楊志敏，葛 劍，王運濤，楊翠軍，劉建成 ，王文濤

(1.張家口市農(nóng)業(yè)科學院，河北 張家口 075000； 2.河北北方學院，河北 張家口 075000；3.張家口學院，河北 張家口 075000)

隨著生物醫(yī)藥等學科的飛速發(fā)展，天然多糖以其抗氧化、促免疫、抗腫瘤、消炎、抗病毒及高效低毒等特性越來越引起人們的關(guān)注[1，2]。馬齒莧(Portulacaoleracea)為馬齒莧科植物馬齒莧的全草，含有氨基酸、維生素等多種營養(yǎng)成分及L-去甲腎上腺素、多巴明、黃酮類和多糖等生物活性物質(zhì)。馬齒莧多糖(Portulacaoleraceapolysaccharide，POP)是馬齒莧的主要有效成分之一，臨床研究認為，POP具有抗腫瘤、抗氧化、降血脂以及免疫增強作用[3-11]。目前,有關(guān)POP在養(yǎng)殖業(yè)上的應(yīng)用研究較少，試驗采用POP口腔灌注雛雞，觀察其對雛雞法氏囊免疫功能的影響，以期揭示POP免疫調(diào)節(jié)的機理，為馬齒莧多糖在畜禽養(yǎng)殖上的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

試驗采用流式細胞儀(BD FACSAria，美國)；試劑為淋巴細胞分離液，PE(苯腎上腺素)熒光標記小鼠抗雞CD4、CD8抗體、碘化丙啶、ConA均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗動物

試驗用1日齡雛雞均由河北北方學院牧業(yè)研究所提供，3層籠養(yǎng)育雛，采用正大蛋雛雞料飼喂，自由采食和飲水。

1.3 馬齒莧多糖的提取

采新鮮馬齒莧全草，經(jīng)50 ℃烘干，粉碎，依次利用石油醚、80%乙醇脫去脂肪和小分子糖類，利用水提取法提取POP，再利用95%乙醇沉淀，離心，依次用無水乙醇、丙酮洗滌，經(jīng)真空干燥制得馬齒莧粗多糖，利用苯酚硫酸法測定多糖含量。

1.4 動物試驗方法

選取1日齡健康蛋雛雞80只，隨機分為4組，分別為1個空白對照組(Ⅰ)和3個馬齒莧多糖試驗組，即試驗Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ(POP劑量25，50和100 mg/kg)組，每組20只雞，馬齒莧多糖經(jīng)雛雞口腔灌服，每天1次，連續(xù)20 d，對照組灌服等量生理鹽水。試驗雞飼喂相同基礎(chǔ)日糧，自由采食和飲水。

1.5 免疫功能檢測

試驗結(jié)束后每組試驗雞無菌采血，EDTA抗凝，分離淋巴細胞，加入熒光標記的CD4、CD8抗體，利用流式細胞儀進行檢測，Cell Quest軟件分析T淋巴細胞亞群百分率；取血后全部剖殺，并無菌摘取法氏囊，準確稱量濕重，計算法氏囊指數(shù)；隨后取適量法氏囊組織塊，利用機械法制備細胞樣品，即取組織塊在200目的銅網(wǎng)上搓，并用PBS向下沖洗細胞，離心收集細胞，經(jīng)400目網(wǎng)過濾，PBS洗滌制成單細胞懸液，調(diào)整細胞數(shù)為1×106個，碘化丙啶綜合染液染色30 min，用流式細胞儀進行檢測，采用Medifit軟件分析處于靜止期(G0/G1期)、DNA合成期(S期)、分裂期(G2/M期)的細胞數(shù)量百分比，計算細胞增殖指數(shù)(PI)。

PI=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)×100%

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0進行分析處理，不同劑量采用多重比較，差異P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，結(jié)果均以“平均值±標準差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 POP對雛雞外周血T淋巴細胞亞群及法氏囊指數(shù)的影響

不同濃度的POP作用于雛雞，均能不同程度地提高雛雞外周血中T淋巴細胞亞群細胞數(shù)量，并顯著提高雛雞法氏囊指數(shù)(P<0.05)(表1)。其中，CD4+T淋巴細胞數(shù)量以50 mg/kg POP試驗組最高為38.47%，顯著高于空白對照組及25 mg/kg組(P<0.05)，與100 mg/kg組差異不明顯(P>0.05)；CD8+T淋巴細胞數(shù)量隨POP濃度的升高也有增加的趨勢，但不同濃度的POP組之間差異不顯著(P>0.05)；CD4+/CD8+以試驗Ⅲ組最高，為1.98，顯著高于其他組(P<0.05)。法氏囊指數(shù)隨POP濃度升高呈先高后低趨勢，在50 mg/kg濃度上達到最高值。

表1 PDP對雛雞外周血T淋巴細胞亞群和法氏囊指數(shù)的影響

注：同行字母不同表示差異顯著(P<0.05)，字母相同表示差異不顯著(P>0.05)，下表同

2.2 POP對雛雞法氏囊淋巴細胞周期及增殖指數(shù)的影響

法氏囊淋巴細胞周期的變化隨POP用藥劑量的增加，G0/G1期細胞數(shù)量逐漸降低，均顯著低于對照組(P<0.05)，但不同濃度的POP試驗組間差異不顯著(P>0.05)；S期細胞數(shù)隨POP濃度的升高逐漸增加，其中，100 mg/kg組達到最高，為8.20%，顯著高于其他組別；G2/M期細胞數(shù)量在50 mg/kg組達到最高值，為6.32%，顯著高于空白對照組及試驗Ⅱ組(P<0.05)，與試驗Ⅳ組差異不顯著(P>0.05)。其中，法氏囊內(nèi)的細胞數(shù)量以G0/G1期為主，占85.97%～91.70%。法氏囊增殖指數(shù)(PI)以100 mg/kg組最高，顯著高于對照及試驗Ⅱ組(P<0.05)，與50 mg/kg 組無明顯差異(P>0.05)。

表2 POP對雛雞法氏囊淋巴細胞周期及增殖指數(shù)的影響

3 討論與結(jié)論

有關(guān)馬齒莧多糖免疫活性的調(diào)節(jié)大多集中在小鼠上，對畜禽免疫能力的影響報道較少。研究結(jié)果表明，隨著馬齒莧多糖濃度增加，雛雞外周血中CD4+T淋巴細胞數(shù)量顯著增加，CD8+T淋巴細胞水平在不同濃度的POP組之間變化不明顯，CD4+/CD8+比值顯著增加。而T淋巴細胞直接參與機體的免疫應(yīng)答，當機體受外界刺激，可使體內(nèi)T淋巴細胞的數(shù)量和免疫活性發(fā)生改變，尤其是CD4+T和CD8+T淋巴細胞水平，CD4+T淋巴細胞具有誘導和增強機體免疫應(yīng)答的作用，CD8+T淋巴細胞主要介導細胞毒殺傷作用，在正常范圍內(nèi)，CD4+/CD8+T淋巴細胞比值升高提示提示正相免疫調(diào)節(jié)占優(yōu)勢。試驗結(jié)果與李淑芳等[12]報道米糠多糖能夠提高健康雛雞外周血CD4+T淋巴細胞比率，對CD8+T淋巴細胞作用不明顯的結(jié)論相似。馬齒莧多糖可直接作用于T淋巴細胞，通過增加CD4+T淋巴細胞數(shù)量，提高CD4+/CD8+T淋巴細胞比值，增強免疫力。

法氏囊是家禽的中樞免疫器官，測定法氏囊指數(shù)能反映機體的防御免疫功能。試驗在不同濃度梯度的馬齒莧多糖均能提高雛雞法氏囊指數(shù)，與魏炳棟等[13]和王關(guān)林等[14]的研究結(jié)果相近，說明適宜的多糖濃度能有效刺激法氏囊的發(fā)育，提高機體主動免疫能力。

試驗中，不同濃度梯度的POP均能增加法氏囊DNA合成期(S期)的淋巴細胞數(shù)量，不同程度地降低靜止期(G0/G1期)淋巴細胞數(shù)量，提高分裂期(G2/M期)的淋巴細胞數(shù)量，從而有效提升法氏囊淋巴細胞增殖指數(shù)。這與劉華等[15]報道的防風多糖能促進小鼠淋巴細胞的增殖效果相似。試驗POP可能通過提高細胞分裂和DNA合成，促進淋巴器官發(fā)育，提高機體免疫功能。

馬齒莧多糖可提高雛雞外周血T淋巴細胞亞群CD4+T淋巴細胞數(shù)量和CD4+/CD8+T淋巴細胞比值，顯著提高雛雞法氏囊指數(shù)，并通過提高法氏囊細胞分裂和DNA合成，促進淋巴器官發(fā)育，提高機體免疫功能，為提高幼齡動物免疫力，開發(fā)綠色無公害飼料添加劑提供了參考依據(jù)。

參考文獻:

[1] 付書婕,王乃平,黃仁彬.植物多糖免疫調(diào)節(jié)作用的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2008,19(1):99-101.

[2] YANG X P,GUO D Y,ZHANG J M,etal.Characterization and antitumor activity of pollen polysaccharide[J].International Immunopharmacology,2007(7):427-434.

[3] 崔旻,尹苗,安利國,等.馬齒莧多糖的抗腫瘤活性[J].山東師大學報,2002,17(1):73-76.

[4] 王曉波,劉殿武,丁月新,等.馬齒莧多糖對小鼠腹腔巨噬細胞免疫功能作用[J].中國公共衛(wèi)生,2005,21(4):462-463.

[5] 王曉波,姜紅,王本華,等.馬齒莧多糖對腫瘤細胞的體內(nèi)外抑制作用[J].中國公共衛(wèi)生,2005,21(12):1485-1486.

[6] LU X H,HE J S,ZHU X Z.Immune effects of polysaccharide from Portulaca oleracea on mice[J].Pharmacol Clin Chin Mater Med,2006,22(3,4):89-90.

[7] DUAN Y F,HAN G P.Study on separating and antioxidative activity of polysaccharides extrated from Portulaca oleracea L.[J].Food Sci,2005,26(3):225-228.

[8] 李小蘭，周愛國．馬齒莧多糖對衰老模型小鼠的抗衰老作用[J]．中國老年學雜志，2009，29(21)：2778-2780．

[9] 劉華，李玉萍，周春麗，等．馬齒莧多糖對前脂肪細胞的抑制作用及體外抗氧化研究[J]．食品科技，2010，35(9)：233-235．

[10] 潘鋒，張濤，陳建永.馬齒莧多糖干預(yù)大鼠潰瘍性結(jié)腸炎Caspase-3 Caspase-8表達的研究[J]．中華中醫(yī)藥學刊，2010，28(8)：1639-1641．

[11] 孫黎，楊翠軍，葛劍，等．馬齒莧多糖對雛雞脾臟免疫功能的影響[J]．黑龍江畜牧獸醫(yī)，2010(11)：137-138．

[12] 李淑芳,李英,張繼東,等.米糠多糖對不同免疫狀態(tài)雛雞外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞亞群的影響[J].河北農(nóng)業(yè)科學,2008,12 (5):74-76.

[13] 魏炳棟,于維,陶浩,等.黃芪多糖對1～14日齡肉仔雞生長性能、臟器指數(shù)及抗氧化能力的影響[J].動物營養(yǎng)學報,2011,23(3):486-491.

[14] 王關(guān)林,宋揚,羅紅梅.莪術(shù)多糖對雛雞抗氧化能力和免疫功能的影響[J].畜牧獸醫(yī)學報,2006,37(11):1184-1188.

[15] 劉華,田嘉銘,孫黎,等.正常小鼠巨噬細胞及外周血淋巴細胞亞群對防風多糖干預(yù)的反應(yīng)[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù),2008,12(18):3475-3478.