消栓通脈顆粒逆轉Th1/Th2亞群失衡治療大鼠深靜脈血栓

東光健+賴楠楠+郝清智+季博+王彬

[摘要] 目的 探討Th1/Th2亞群失衡在大鼠深靜脈血栓形成（DVT）中的作用及中藥復方消栓通脈顆粒逆轉Th1/Th2亞群失衡治療DVT的作用機制。 方法 80只DVT大鼠隨機分為消栓通脈顆粒組、DVT組、假手術組、正常組，分離大鼠脾臟單個核細胞，流式細胞術檢測各組大鼠Th1亞群（CD4+TNF-α+）、Th2亞群（CD4+IL-4+）比例，ELISA法檢測大鼠外周血TNF-α、IL-4水平。 結果 與正常組及假手術組比較，DVT大鼠脾臟Th1亞群比例顯著升高（P=0.022），Th2亞群比例顯著降低（P=0.015）；血清TNF-α水平顯著升高（P=0.005）；IL-4水平顯著降低（P=0.012）。消栓通脈顆粒作用后，大鼠脾臟Th1亞群比例顯著降低（P=0.008），Th2亞群比例顯著升高（P=0.011），血清TNF-α水平降低（P=0.036），IL-4水平升高（P=0.018）。 結論 Th1/Th2亞群失衡參與了大鼠DVT發病過程，消栓通脈顆粒誘導T細胞向Th2亞群偏移，抑制炎性因子表達進而減輕炎癥反應，保護血管內皮細胞，促進血栓再通。

[關鍵詞] 消栓通脈顆粒；Th1/Th2亞群；深靜脈血栓形成；細胞因子

[中圖分類號] R285.5???[文獻標識碼] A???[文章編號] 2095-0616（2014）11-13-04

Regulatory effect of traditional Chinese medicine on Th1/Th2 subsets contributes to the treatment of deep vein thrombosis

DONG?Guangjian1??LAI?Nannan2??HAO?Qingzhi3??JI?Bo3??WANG?Bin3

1.Shandong Workers Hospital of Geology and Mineral Resources,Jin'an 250013,China;2.Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jin'an 250062,China;3.Peripheral Vascular Surgery Department,Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jin'an 250014,China

[Abstract] Objective To evaluate the role of Th1/Th2 shift in deep vein thrombasis (DVT) and elucidate the mechanism of Traditional Chinese Medicine (TCM) -Xiaoshuantongmai Decoction-in treating DVT animal models. Methods 40 DVT rats were divided randomLy in to DVT group and TCM group.Additionally, 20 rats with sham operation were taken as sham operation group and 20 normal rats were taken as normal group respectively. Rats of TCM group were treated with Xiaoshuantongmai Decoction for 8-15 days,while rats of other groups were treated with double distilled water for the same duration. Then,the proportions of Th1 (CD4+TNFα+) subset and Th2 (CD4+IL-4+) subset were detected by Flowcytometry. Moreover,the protein expressions of TNF-α and IL-4 in rat serum were analyzed by ELISA assay. Results Compared with normal and sham operation group, the proportion of Th1 subset was increased while that of Th2 subset was decreased significantly in DVT group. In addition,protein expression of TNF-α was enhanced while that of IL-4 was inhibited markedly in DVT rats. After TCM administration,the proportion of Th1 subset was down-regulated while that of Th2 subset was up-regulated significantly in DVT rats. Moreover,the protein expression of TNF-α decreased while that of IL-4 increased obviously after TCM administration. Conclusion Th1/Th2 shift was involved in DVT.TCM- Xiaoshuantongmai decoction-down-regulated the Th1 subsets whereas up-regulated the Th2 subsets;thereby, Xiaoshuantongmai decoction exerted the curative effect on DVT mice.

[Key words] Xiaoshuantongmai decoction;Th1/Th2 subsets;Deep vein thrombosis; Cytokine

深靜脈血栓形成（deep vein thrombosis，DVT）

1是周圍血管病科常見病及多發病，年發病率約1.0‰[1]，且有逐年升高趨勢。在急性期容易出現肺栓塞而危及生命，慢性期可以出現患肢腫脹、淤積性皮炎、頑固性小腿潰瘍等后遺癥，嚴重影響患者生活質量。前期研究證實，DVT模型大鼠存在細胞因子網絡失衡的現象[2]，但導致這一現象的免疫學根源尚未明確。Th1/Th2亞群是免疫調節的主體，通過產生特征性細胞因子，在抵抗病原體感染及維持機體內環境穩定中發揮著重要作用，參與了多種疾病的發生與發展，但其在DVT中的作用及機制尚未闡明。本實驗通過建立大鼠DVT模型，觀察模型大鼠Th1/Th2亞群變化，闡釋其在DVT發病中的作用，并觀察中藥復方消栓通脈顆粒干預后DVT大鼠Th1/Th2亞群分化狀態及炎性細胞因子的表達，揭示該中藥復方治療本病的作用靶點與機制。

endprint

1?材料與方法

1.1?主要材料

Wistar大鼠80只，12周齡，體重200～250g，♂，SPF級，購自山東大學實驗動物中心（許可證號：SCXK魯20090001）。大鼠自由飲水和攝食，飼養室溫度23～25℃，相對濕度7%左右，定期紫外線室內消毒，適應性飼養3d后開始實驗。消栓通脈顆粒（山東中醫藥大學附屬醫院藥劑科制備，魯藥制字 Z0120030051）。藥物組成：茵陳、桃仁、赤芍等。制備：用蒸餾水制成懸濁液，每1mL含0.6g消栓通脈顆粒。生理鹽水（山東華魯制藥有限公司生產，H37022750）。大鼠抗小鼠熒光抗體：FITC-CD4、PE-IL-IFNγ、PE-IL-4均購自美國BD Pharmigen公司。

1.2?DVT大鼠模型建立

根據Reyers法建立大鼠深靜脈血栓形成模型40只，隨機分為實驗組與模型組，各20只。造模術后動物自由飲水，普通全價顆粒飼料，不用抗生素，按照人與動物公斤體重比值進行藥物劑量的折算。實驗組灌胃消栓通脈顆粒組，劑量為0.6g/（100g·d），連續灌胃8～15d。模型組：連續灌胃生理鹽水8~15d。假手術組：20只大鼠，麻醉后，分離下腔靜脈，不予結扎，直接縫合腹膜、皮膚，術后給予生理鹽水連續灌胃8~15d。20只正常大鼠作為正常對照組，給予生理鹽水連續灌胃8～15d。

1.3?標本收集與Th1、Th2亞群檢測

參照文獻報道[3]，無菌分離大鼠脾臟，針栓研磨制成單細胞懸液，200目銅網過濾，調整細胞濃度為1×106個/mL，加入佛波酯30μg/L、離子霉素（Ionomycin）1mg/L、莫能霉素（Monensin）1.7μg/L，37℃，5% CO2孵育4h。收集細胞，1×PBS洗2遍，去上清，加入小鼠血清，室溫避光孵育30min。將外標抗體FITC-CD4按說明書加入到細胞懸液中，4℃避光孵育30min；1×PBS洗2遍，去上清；BD固定穿膜試劑盒固定穿膜（按說明書操作），加入內標抗體（PE-TNF-α、PE-IL-4），4℃避光孵育30min；穿膜緩沖液洗2次，去上清，PBS重懸細胞，轉管，上機檢測。Winmidin 2.9分析Th1（CD4+TNF-α+）及Th2（CD4+IL-4+）亞群比例。

1.4?Th1、Th2細胞炎性細胞因子的檢測

采用ELISA法，所有步驟均按照說明書進行，通過標準曲線求得血清中TNF-α、IL-4蛋白濃度。

1.5?統計學分析

應用SPSS11.5軟件，計量資料以（）表示。采用One Way-ANOVA方差分析，兩組間比較采用Turkey法檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2?結果

2.1?Th1、Th2亞群比例及消栓通脈顆粒對其影響

造模后第8天，與正常組大鼠比較，實驗組、模型組、假手術組大鼠Th1亞群比例顯著升高（P=0.022），Th2亞群比例顯著降低（P=0.015）；模型組大鼠Th1亞群比例顯著高于實驗組（P=0.013），Th2亞群比例顯著低于實驗組（P=0.021）。消栓通脈顆粒作用15d后，實驗組大鼠Th1亞群比例顯著降低（P=0.008），Th2亞群比例顯著升高，與模型組比較有顯著性差異（P=0.011），與假手術組及正常組大鼠比較無明顯差異（P=0.153）。提示Th1/Th2亞群偏移參與了大鼠DVT形成，消栓通脈顆粒對DVT大鼠Th1/Th2亞群分化狀態具有調節作用，能優勢誘導Th2亞群偏移。見表1。

表1??大鼠Th1/Th2亞群占CD4+細胞百分比及藥物對其影響（，%）

組別 只數 藥物作用天數

（d） Th1亞群

（CD4+TNF-α+） Th2亞群

（CD4+IL-4+）

實驗組 10 8 25.45±5.44abc 2.70±0.55abc

10 15 17.32±4.16f 3.95±0.63f

模型組 10 8 32.64±3.52ab 2.15±0.42ab

10 15 26.60±3.85de 2.80±0.54de

假手術組 10 8 20.43±4.25ac 3.22±0.48ac

10 15 16.08±3.60f 3.64±0.76f

正常組 10 8 15.45±3.60c 3.89±0.84c

10 15 15.26±3.21f 3.83±0.74f

注：術后第8天，與正常組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05，與模型組比較，cP＜0.05；術后第15天，與正常組比較，dP＜0.05；與假手術組比較，eP＜0.05；與模型組比較，fP＜0.05

2.2?血清TNF-α、IL-4水平及消栓通脈顆粒對其影響

造模后第8d，與正常組大鼠比較，實驗組、模型組、假手術組大鼠TNF-α水平顯著升高（P=0.005），IL-4水平顯著降低（P=0.012）；實驗組TNF-α水平明顯低于模型組、IL-4水平明顯高于模型組（P=0.033）。造模第15天后，實驗組大鼠TNF-α表達明顯降低（P=0.036），IL-4表達明顯升高（P=0.018），與正常組、假手術組比較無顯著性差異（P=0.421）；模型組大鼠TNF-α表達明顯高于實驗組，IL-4表達明顯低于實驗組，差異有顯著性（P=0.003）。提示Th1型細胞因子TNF-α蛋白表達升高及Th2型細胞因子IL-4蛋白表達降低參與了DVT的形成過程，消栓通脈顆粒通過調節Th1/Th2亞群比例，降低Th1型細胞因子表達，增加Th2型細胞因子表達，其對TNF-α、IL-4水平的調節作用呈明顯劑量與時間依賴性，證實其對Th1/Th2亞群分化的調節作用是其減輕炎性細胞因子介導的炎癥反應，保護血管內皮治療DVT作用的靶點之一。見表2。

表2??大鼠外周血TNF-α、IL-4水平（，pg/mL）

組別 只數 藥物作用天數

（d） Th1型細胞

因子TNF-α Th2型細胞因子

IL-4

實驗組 10 8 198.45±13.94abc 103.12±9.75abc

10 15 142.32±15.16f 147.95±11.63f

模型組 10 8 220.64±13.52ab 92.45±12.42ab

10 15 182.60±15.85de 122.25±10.54de

假手術組 10 8 180.43±14.25ac 113.04±10.68ac

10 15 144.08±13.20f 140.75±12.76f

正常組 10 8 130.45±13.60bc 143.89±10.84bc

10 15 135.26±16.21f 140.53±11.50f

注：術后第8天，與正常組比較，aP＜0.05；與假手術組比較，bP＜0.05，與模型組比較，cP＜0.05；術后第15天，與正常組比較，dP＜0.05；與假手術組比較，eP＜0.05；與模型組比較，fP＜0.05

3?討論

T細胞是機體免疫調節的主體細胞，在抵御外界病原體感染及維持機體內環境穩定中發揮著重要作用[4]。初始T細胞受抗原刺激后，在分化誘導因子及特異性核轉錄因子作用下分化為不同的亞群，產生特異性細胞因子，主導不同的免疫反應[5]。初始T細胞經IFN-γ和IL-12誘導分化成Th1亞群，主要分泌TNF-α等炎性細胞因子，誘導機體炎癥反應，增強細胞毒性T細胞和NK細胞的活性，從而促進細胞免疫應答。初始T細胞經IL-4誘導分化Th2亞群，分泌IL-4和IL-10等抑制性細胞因子，能拮抗性抑制Th1型細胞因子介導的炎癥反應，使機體的免疫應答限制在適度范圍，避免過強的炎癥反應導致的組織損傷。Th1/Th2亞群相互調節，處于動態平衡之中[6-7]，維持機體正常免疫功能及自穩狀態；Th1/Th2亞群參與了多種疾病的發病過程，但其在DVT中的作用機制尚未闡明[8-9]。

endprint

Th1型細胞因子TNFα可以通過促進脂質沉積和誘導巨噬細胞聚集，誘導巨噬細胞凋亡，產生過量的單核細胞趨化因子-1（macophage/monocyte chemotactic protein1，MCP-1），導致內皮損傷而促進血管炎癥反應[10-11]。Th2型細胞因子IL-4可以抑制TNFα的產生，同時抑制TNFα對巨噬細胞的活化作用，減輕炎癥反應，調節Th1/Th2平衡，抑制炎癥反應，從而保護內皮細胞[12-13]。本研究發現，在DVT初期，Th1炎性細胞因子比例明顯，Th2亞群比例明顯降低，Th1炎性細胞因子占主導地位，提示Th1/Th2亞群偏移參與了DVT形成過程。此時T細胞在MCP-1的作用下，與血管內皮細胞結合，以滲出的方式透過內皮細胞層進入內皮下，參與炎癥反應，加重內皮損傷，促進了血栓形成[14-15]。經過中藥復方治療后，實驗組Th1亞群比例及促炎因子表達降低，Th2亞群比例及抗炎因子表達升高。

消栓通脈顆粒具有清熱利濕、祛瘀通絡的功效。消栓通脈顆粒中茵陳、赤小豆清熱利濕，行血消腫共為君藥。赤芍藥清熱涼血，活血化瘀，水蛭破血逐瘀；通經消癥；黃柏清熱燥濕，瀉火解毒，三藥相須配伍合而為臣藥，既助君藥祛濕、清熱、活血，又能涼血活血、破血祛瘀、軟堅散結，使血脈通暢，水腫自消。山梔清熱，蒼術功擅燥濕健脾，桃仁、紅花活血散瘀。諸藥合用，共奏清熱利濕，祛瘀通絡，消腫止痛之功效，使濕化、熱清、瘀祛，脈絡通暢[16]。我們的前期研究證實，DVT急性期炎性細胞因子表達增高，消栓通脈顆粒可以保護血管內皮細胞，降低炎性細胞因子表達[17-18]。本研究發現經消栓通脈顆粒治療后，DVT大鼠Th1亞群比例降低，Th2亞群比例升高，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示優勢誘導T細胞亞群向Th2漂移，逆轉Th1/Th2亞群失衡是消栓通脈顆粒治療DVT的靶點與分子機制。本研究進一步闡釋了DVT形成的免疫學分子機制及消栓通脈顆粒治療本病的靶點，為精確制導臨床治療提供了新的途徑，為治療DVT中藥研發提供了實驗依據。但在DVT發病過程中，Th1/Th2亞群失衡的始動因素及信號通路關鍵分子變化與機制尚未明確，有待進一步深入探討。

[參考文獻]

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[17] 王彬，劉明，張玉東，等. 消栓通脈顆粒調節Treg/Th17亞群平衡治療下肢深靜脈血栓形成研究[J].山東中醫藥大學學報，2013，37（3）：203-205.

[18] 王彬，劉明，郝清智. 中藥調節Th1/Th2免疫平衡在下肢深靜脈血栓形成治療中的作用[J].中國中西醫結合外科雜志，2013，9（4）：355-358.

（收稿日期：2014-03-09）

endprint

Th1型細胞因子TNFα可以通過促進脂質沉積和誘導巨噬細胞聚集，誘導巨噬細胞凋亡，產生過量的單核細胞趨化因子-1（macophage/monocyte chemotactic protein1，MCP-1），導致內皮損傷而促進血管炎癥反應[10-11]。Th2型細胞因子IL-4可以抑制TNFα的產生，同時抑制TNFα對巨噬細胞的活化作用，減輕炎癥反應，調節Th1/Th2平衡，抑制炎癥反應，從而保護內皮細胞[12-13]。本研究發現，在DVT初期，Th1炎性細胞因子比例明顯，Th2亞群比例明顯降低，Th1炎性細胞因子占主導地位，提示Th1/Th2亞群偏移參與了DVT形成過程。此時T細胞在MCP-1的作用下，與血管內皮細胞結合，以滲出的方式透過內皮細胞層進入內皮下，參與炎癥反應，加重內皮損傷，促進了血栓形成[14-15]。經過中藥復方治療后，實驗組Th1亞群比例及促炎因子表達降低，Th2亞群比例及抗炎因子表達升高。

消栓通脈顆粒具有清熱利濕、祛瘀通絡的功效。消栓通脈顆粒中茵陳、赤小豆清熱利濕，行血消腫共為君藥。赤芍藥清熱涼血，活血化瘀，水蛭破血逐瘀；通經消癥；黃柏清熱燥濕，瀉火解毒，三藥相須配伍合而為臣藥，既助君藥祛濕、清熱、活血，又能涼血活血、破血祛瘀、軟堅散結，使血脈通暢，水腫自消。山梔清熱，蒼術功擅燥濕健脾，桃仁、紅花活血散瘀。諸藥合用，共奏清熱利濕，祛瘀通絡，消腫止痛之功效，使濕化、熱清、瘀祛，脈絡通暢[16]。我們的前期研究證實，DVT急性期炎性細胞因子表達增高，消栓通脈顆粒可以保護血管內皮細胞，降低炎性細胞因子表達[17-18]。本研究發現經消栓通脈顆粒治療后，DVT大鼠Th1亞群比例降低，Th2亞群比例升高，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示優勢誘導T細胞亞群向Th2漂移，逆轉Th1/Th2亞群失衡是消栓通脈顆粒治療DVT的靶點與分子機制。本研究進一步闡釋了DVT形成的免疫學分子機制及消栓通脈顆粒治療本病的靶點，為精確制導臨床治療提供了新的途徑，為治療DVT中藥研發提供了實驗依據。但在DVT發病過程中，Th1/Th2亞群失衡的始動因素及信號通路關鍵分子變化與機制尚未明確，有待進一步深入探討。

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（收稿日期：2014-03-09）

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Th1型細胞因子TNFα可以通過促進脂質沉積和誘導巨噬細胞聚集，誘導巨噬細胞凋亡，產生過量的單核細胞趨化因子-1（macophage/monocyte chemotactic protein1，MCP-1），導致內皮損傷而促進血管炎癥反應[10-11]。Th2型細胞因子IL-4可以抑制TNFα的產生，同時抑制TNFα對巨噬細胞的活化作用，減輕炎癥反應，調節Th1/Th2平衡，抑制炎癥反應，從而保護內皮細胞[12-13]。本研究發現，在DVT初期，Th1炎性細胞因子比例明顯，Th2亞群比例明顯降低，Th1炎性細胞因子占主導地位，提示Th1/Th2亞群偏移參與了DVT形成過程。此時T細胞在MCP-1的作用下，與血管內皮細胞結合，以滲出的方式透過內皮細胞層進入內皮下，參與炎癥反應，加重內皮損傷，促進了血栓形成[14-15]。經過中藥復方治療后，實驗組Th1亞群比例及促炎因子表達降低，Th2亞群比例及抗炎因子表達升高。

消栓通脈顆粒具有清熱利濕、祛瘀通絡的功效。消栓通脈顆粒中茵陳、赤小豆清熱利濕，行血消腫共為君藥。赤芍藥清熱涼血，活血化瘀，水蛭破血逐瘀；通經消癥；黃柏清熱燥濕，瀉火解毒，三藥相須配伍合而為臣藥，既助君藥祛濕、清熱、活血，又能涼血活血、破血祛瘀、軟堅散結，使血脈通暢，水腫自消。山梔清熱，蒼術功擅燥濕健脾，桃仁、紅花活血散瘀。諸藥合用，共奏清熱利濕，祛瘀通絡，消腫止痛之功效，使濕化、熱清、瘀祛，脈絡通暢[16]。我們的前期研究證實，DVT急性期炎性細胞因子表達增高，消栓通脈顆粒可以保護血管內皮細胞，降低炎性細胞因子表達[17-18]。本研究發現經消栓通脈顆粒治療后，DVT大鼠Th1亞群比例降低，Th2亞群比例升高，兩組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），提示優勢誘導T細胞亞群向Th2漂移，逆轉Th1/Th2亞群失衡是消栓通脈顆粒治療DVT的靶點與分子機制。本研究進一步闡釋了DVT形成的免疫學分子機制及消栓通脈顆粒治療本病的靶點，為精確制導臨床治療提供了新的途徑，為治療DVT中藥研發提供了實驗依據。但在DVT發病過程中，Th1/Th2亞群失衡的始動因素及信號通路關鍵分子變化與機制尚未明確，有待進一步深入探討。

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（收稿日期：2014-03-09）

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