S100A4在非小細胞肺癌中的表達及對肺癌A549細胞生物學行為的影響

楊 洋 樊玉霞 劉東雷 吳 愷 溫豐標 趙 松

(鄭州大學第一附屬醫院胸外科 河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室，河南 鄭州 450052)

非小細胞肺癌(NSCLC)約占肺癌總發病率的80%，起病隱襲，早期癥狀不典型，確診時常已處于進展期，失去了最佳手術時機，5年生存率僅為15%〔1〕。肺癌預后較差不僅與早期診斷率低有關，更主要的是其較高的侵襲和轉移能力。腫瘤的侵襲和轉移需要細胞表面黏附相關分子的改變，此過程與腫瘤細胞的鈣離子蛋白A4(S100A4)有著密不可分的關系〔2〕。本文通過觀察S100A4對肺癌A549細胞增殖的影響，探討S100A4與肺癌發生的關系和對治療的指導意義。

1 資料和方法

1.1材料 收集2012年10月至2013年12月在鄭州大學第一附屬醫院胸外科行外科手術切除的NSCLC標本及配對正常肺組織各67例。兔抗人S100A4多克隆抗體購自美國Cell Signaling Technology，S-P免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物科技有限公司，CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1免疫組織化學 采用免疫組織化學S-P法，按照試劑盒說明操作。切片脫蠟、水化，經PBS漂洗后在3%過氧化氫溶液中孵育5～10 min。用抗原修復液修復抗原后加入山羊非免疫血清工作液封閉，滴加一抗工作液后4℃過夜，PBS漂洗后加入二抗工作液以及鏈酶卵白素工作液，二氨基聯苯胺顯色后蘇木素復染細胞核。

1.2.2結果判斷 由2位病理科醫師在不知道患者臨床資料的情況下，獨立觀察每張切片，每例切片在400倍鏡下隨機選取3個視野。首先根據染色強度(A)進行半定量計分：不染色為0分，輕度染色(淡黃色)為1分，重度染色(棕黃色)為2分，強染色(褐色)為3分；然后按照陽性細胞比例(B)評分：陽性細胞<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。免疫組織化學染色結果A×B，將結果分為0分，陰性(-)；1～4分，弱陽性(+)；5～8分，中度陽性()；9～12分，強陽性()。

1.2.3CCK-8法檢測細胞活力 選對數生長期細胞，接種于96孔板，將不同濃度的重組人S100A4蛋白2、4、6、8、10 μg/ml分別與A549細胞在恒溫孵箱中共同培養48 h。實驗結束后向每孔加入10 μl CCK-8溶液繼續孵育4 h，用酶標儀測定在450 nm處的吸光度A值，計算生長抑制率(IR)=1-(A實驗組/A對照組)×100%。

1.2.4細胞周期分析 取4 μg/ml 和6 μg/ml 重組人S100A4蛋白處理48 h后的A549細胞，0.2%胰蛋白酶消化，1 000 r/min離心5 min，棄去上清；用PBS洗兩遍，離心后棄去，加入70%冰乙醇固定30 min，4℃過夜；上機前，1 000 r/min離心5 min，棄去乙醇，PBS漂洗三遍；加入1 ml PBS制成細胞懸液，加RnaseA(終濃度50 μg/ml)，室溫放置1 h；調整細胞濃度為1×106，加1 ml碘化吡啶(100 μg/ml)，避光30 min，最后通過流式細胞儀檢測細胞周期。

2 結 果

2.1S100A4在NSCLC組織中的表達與臨床資料、病理參數的關系 S100A4蛋白的陽性反應物質呈棕黃色或棕褐色，主要定位于胞質內，少量位于胞核或胞膜上。S100A4在癌組織中呈顯著高表達(49/67，73.1%)，顯著高于正常肺組織(9/67，13.4%)，且其在肺腺癌中的陽性表達率明顯高于肺鱗癌和大細胞肺癌；伴淋巴結轉移的NSCLC標本中的S100A4陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移的標本，但S100A4陽性表達率與患者年齡、性別、腫瘤位置及分化程度無明顯相關(P>0.05)。見圖1，表1。

2.2S100A4蛋白對肺癌A549細胞生物學行為的影響 S100A4蛋白具有促進肺癌A549細胞增殖的作用，且呈濃度依賴性(圖2)。同時，應用流式細胞術檢測發現，與未加任何干預的A549細胞相比，4 μg/ml 和6 μg/ml 重組人S100A4蛋白處理48 h后的肺癌細胞，G0/G1期細胞百分比分別由78.24%下降至69.12%、58.79%，S期細胞百分比由14.75%上升至18.64%、24.03%，G2/M期由7.03%上升至13.24%、17.18%(P<0.05)。

A：肺腺癌，B：肺鱗癌，C：大細胞肺癌，D：正常肺上皮組織

圖2 不同濃度重組人S100A4蛋白對肺癌A549細胞增殖能力的影響

表1 S100A4蛋白表達與臨床病理因素的關系〔n(%)〕

3 討 論

S100A4是鈣結合蛋白家族的重要成員，具有EF雙螺旋結構，主要通過改變細胞骨架結構參與細胞凋亡、增殖、細胞黏附、信號傳導、細胞運動等多種生命活動，在腫瘤浸潤轉移中可能扮演重要角色〔3〕。近年來有多項研究發現S100A4在多種腫瘤細胞中存在過表達現象，與惡性腫瘤的發生、侵襲、轉移和預后差密切相關〔4～6〕，提示S100A4很有可能是基因治療腫瘤的一個有效靶點。

通過本文結果筆者推測S100A4蛋白可能作為致癌因子參與了NSCLC的發生、侵襲、轉移的重要環節。S100A4蛋白處理的肺癌A549細胞增殖活力明顯增強，且具有濃度依賴性推測S100A4蛋白在NSCLC組織中高表達，提高了腫瘤細胞的增殖活力，加速了腫瘤進展，但目前其分子機制尚有待進一步研究。S100A4可能成為抗腫瘤過程中的有效靶點，為腫瘤的基因治療提供了新的方向。

4 參考文獻

1童燕翔，洪志鵬.微創外科在肺癌綜合治療中的進展〔J〕.中華肺部疾病雜志，2013；6(1)：56-8.

2Bettum IJ，Vasiliauskaite K，Nygaard V，etal. Metastasis-associated protein S100A4 induces a network of inflammatory cytokines that activate stromal cells to acquire pro-tumorigenic properties 〔J〕. Cancer Lett，2014;344(1):28-39.

3Ramagopal UA，Dulyaninova NG，Varney KM，etal. Structure of the S100A4/myosin-IIA complex 〔J〕. BMC Struct Biol，2013;13:31.

4Liang J，Piao Y，Holmes L，etal. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4 〔J〕. Clin Cancer Res，2014; 20(1):187-98.

5Roh J，Knight S，Chung JY，etal. S100A4 expression is a prognostic indicator in small intestine adenocarcinoma 〔J〕.J Clin Pathol，2014; 67(3):216-21.

6Rasanen K，Sriswasdi S，Valiga A，etal. Comparative secretome analysis of epithelial and mesenchymal subpopulations of head and neck squamous cell carcinoma identifies S100A4 as a potential therapeutic target 〔J〕. Mol Cell Proteomics，2013; 12(12):3778-92.