CADM1與DAL-1/4.1B在結直腸癌中的表達

張 茹 徐正磊 譚慶紅

(暨南大學第二臨床醫(yī)學院深圳市人民醫(yī)院消化內科,廣東 深圳 518000)

結直腸癌(CRC)治療以手術為主，輔以放化療、中醫(yī)藥等綜合治療，費用高，治療后復發(fā)常見，患者生存時間和生存質量欠佳。該病致病機制研究認為，癌基因、抑癌基因及DNA修復基因的改變，尤其是癌基因的突變、缺失是CRC發(fā)病的重要原因〔1，2〕。細胞黏附分子1/肺癌抑制因子-1(CADM1/TSLC1)在對肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CADM1廣泛表達在人體正常組織中，而該基因在癌組織中的啟動子高甲基化，導致其表達減少。其他研究表明CADM1在上皮來源腫瘤發(fā)病機制中發(fā)揮不容忽視的作用〔3〕。肺癌差異表達基因(DAL-1)是具有維持細胞膜穩(wěn)定作用的一類細胞膜骨架蛋白，且與細胞內信號轉導和細胞間相互作用密切相關〔2〕，研究推測DAL-1不僅能維持正常腸道組織結構和正常腸道上皮細胞的增殖及黏附作用且具有阻止腸上皮細胞惡性轉變的功能〔4〕。CADM1和DAL-1基因共同參與穩(wěn)定細胞骨架及維持細胞黏附性，在CRC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的抑癌作用，當失活或缺失時導致腫瘤發(fā)生、轉移或侵襲。本研究探討兩種基因在CRC中的可能表達機制。

1 資料與方法

1.1資料 選取2010年11月至2013年3月在我院行結腸鏡切除或開腹手術切除治療的患者，35例標本均經(jīng)病理學確診，未接受化療；低分化5例、中分化16例、高分化14例；淋巴結轉移21例；遠處轉移18例。結直腸腺瘤標本15例。距CRC癌中心10 cm處的正常組織35例，其中男21例，女14例，年齡31～72〔平均(57.1±12.2)〕歲。根據(jù)Dukes分期，癌組織經(jīng)病理檢查后，A+B期14例，C+D期21例。

1.2方法

1.2.1材料 選取美國Santa Cruz Biotechnology 公司生產(chǎn)的兔抗人多克隆抗體CADM1和Abcam公司生產(chǎn)的DAL-1/4.1B兔抗人多克隆抗體，免疫組化所用的鏈霉親和素-生物素復合物(SABC)試劑盒和二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉公司。

1.2.2檢測方法 所有標本中均置入組織保存液，用10%中性緩沖甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片厚度為5 μm，蘇木素-伊紅(HE)染色進行病理診斷和分型。采用SABC法和Western 印跡法檢測CADM1和DAL-1/4.1B的表達。蛋白質印跡檢測的標本組織去除周圍脂肪組織，沖洗殘留血液，放入冰盒中，存放于-80℃低溫冰箱備用。

1.2.3免疫組織化學SABC法 組織標本經(jīng)處理后，采用二甲苯進行脫蠟處理，對組織進行水化、修復抗原、滴加一抗CADM1及DAL-1/4.1B(1∶100)與靶蛋白結合、生物素化二抗(1∶200)及SABC試劑與一抗結合、DNA顯色、HE復染、脫水、透明和封片處理。用已知的正常結直腸組織切片(CADM1及DAL-1/4.1B陽性)作為陽性對照，磷酸鹽緩沖液(PBS)緩沖液代替一抗作陰性對照，進行鏡下觀察。

1.2.4Western 印跡 將凍存于-80℃冰箱中的組織標本取出，按照提取細胞和組織標本總蛋白、二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度、配置10%蛋白分離膠和5%積層膠、變性蛋白和上樣、蛋白電泳、轉膜、封閉、一抗與靶蛋白結合、過氧化物酶標記二抗與相應一抗結合、增強化學發(fā)光法(ECL)檢測和半定量分析進行操作。將X線片放置于UVI凝膠成像系統(tǒng)攝影，用圖像分析軟件Quantity one分析條帶灰度值，用目的條帶/β-actin代表分子相對表達量。

1.3染色結果評價〔5〕采用Olympus顯微鏡和顯微攝像儀觀察染色組織并照相記錄，圖像分析采用HMIAS-2000型全自動彩色圖像分析系統(tǒng)。CADM1與DAL-1/4.1B蛋白均以細胞質或細胞膜內出現(xiàn)棕黃色顆粒作為陽性判斷標準。采用染色強度和陽性細胞百分比乘積計量陽性情況：乘積≥2分為免疫組織化學陽性，<2分為陰性。染色強度：無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞百分比：高倍鏡下(×400)按照隨機選取每張切片5個視野觀察細胞，每個視野500個細胞，根據(jù)計算陽性細胞所占百分比：陰性為0分，陽性細胞<10%為1分，陽性細胞10%～50%為2分，陽性細胞>50%為3分。

1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS14.0軟件進行t檢驗和Pearson相關分析。

2 結 果

2.1CADM1與DAL-1/4.1B蛋白的表達 CADM1和DAL-1/4.1B蛋白的陽性以細胞膜或細胞質有棕黃色顆粒為標準。結果發(fā)現(xiàn)，陽性細胞散在分布，多數(shù)位于結直腸癌腺體和細胞膜上，組織間質較少。CADM1和DAL-1/4.1B蛋白在CRC組織的表達顯著低于正常結直腸組織(P<0.05)。但CADM1和DAL-1/4.1B蛋白在腺瘤組織中的表達雖然低于正常對照組，但差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 CADM1和DAL-1/4.1B蛋白在三組中的表達〔n(%)〕

2.2CADM1與DAL-1/4.1B蛋白與β-actin 灰度值比值比較 采用圖像分析軟件Quantity one分析條帶灰度值，用目的條帶/β-actin代表分子相對表達量，結果顯示，CRC組織中CADM1和DAL-1/4.1B蛋白的灰度值與β-actin灰度值的比較顯著小于腺瘤組和正常對照組(P<0.05)。見表2。

表2 CADM1和DAL-1/4.1B蛋白與β-actin灰度值比值比較±s)

2.3CADM1和DAL-1/4.1B相關性 二者與β-actin灰度值比值呈正相關(r=0.707，P<0.05)。且根據(jù)Dukes分期，發(fā)現(xiàn)在Dukes分期C+D中兩者表達的陽性率顯著低于A+B分期(P<0.05)。

2.4CRC臨床病理學特征與CADM1與DAL-1/4.1B蛋白表達關系 CADM1和DAL-1/4.1B蛋白僅與Dukes分期C+D中的表達陽性率相關(P<0.05)。見表3。

表3 CRC臨床病理學特征與CDM1、DAL-1/4.1B蛋白表達的關系(n)

3 討 論

腫瘤的侵襲轉移是一個動態(tài)、復雜、多步驟的過程，腫瘤細胞與血管內皮細胞之間的黏附是腫瘤復發(fā)與轉移的關鍵步驟之一〔6〕。細胞黏附是由細胞間以及細胞與細胞外基質連接的一類跨膜糖蛋白介導的，在腫瘤的浸潤及轉移過程中起著非常重要的作用〔7〕。而與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關的CADMA1級聯(lián)抑癌基因通路發(fā)揮著重要作用。CADM1級聯(lián)抑癌基因通路包括：CADM1、DAL-1及MPP3三個基因。目前已發(fā)現(xiàn)CADM1級聯(lián)抑癌基因在部分人CRC細胞系和病理組織標本中表達明顯減少甚至消失，并且基因啟動子高甲基化狀態(tài)是調控該通路基因表達的一個主要機制。統(tǒng)計分析結果顯示，該抑癌基因通路表達變化還具有隨著CRC患者病情進展而愈加明顯的趨勢。DAL-1/4.1B/ EPB41L3基因是蛋白4.1超家族中的一員，位于染色體18p11.3，是一種抑癌基因，該基因首先在小鼠大腦神經(jīng)髓鞘的副結區(qū)被發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)其存在于多種組織器官中〔8〕。并認為DAL-1在構成細胞膜和聯(lián)通細胞質內通路蛋白信號發(fā)揮重要作用〔9〕。在CRC研究方面，國內外對于CADM1級聯(lián)通路的研究較少，本研究希望研究CADM1和DAL-1/4.1B在結直腸癌中的作用機制，了解其在結直腸癌中所發(fā)揮的作用，為結直腸癌未來的診斷治療工作提高有效的理論依據(jù)〔10〕。

實驗結果顯示，CADM1與DAL-1/4.1B蛋白與結直腸癌的發(fā)生發(fā)展具有密切關系。分析原因可能為CADM1、DAL-1及MPP3基因共同構成了在上皮細胞內發(fā)揮級聯(lián)抑癌作用的通路，CADM1的 PDZ和FERM結合基序與DAL-1和MPP3相互連接形成的三聚體在維持正常組織結構、細胞間黏附、細胞極性及形態(tài)發(fā)揮舉足輕重的作用，該通路失活可能導致腫瘤發(fā)生發(fā)展，且啟動子高甲基化可能是調控該通路的一個重要分子機制。通過實驗及研究，可以認為CADM1與DAL-1/4.1B蛋白是組織肌動蛋白骨架的重要構成因素，且CADM1的失活會直接引起級聯(lián)通路中DAL-1和MPP3在組織中表達的減少，對膜穩(wěn)定產(chǎn)生影響。且實驗中的免疫組織化學結果顯示，在結直腸組織中，CADM1和DAL-1/4.1B的表達部位相近，二者灰度值及染色強度等均呈明顯相關性。因此，CADM1和DAL-1/4.1B的表達程度與CRC的發(fā)生進展具有密切的聯(lián)系。但是，也有研究顯示，基于4.1B敲除小鼠的研究顯示4.1B蛋白可能抑制癌癥的發(fā)生和轉移，可是小鼠本身未見任何表型變化〔9〕。因此推斷，CADM1在CRC的發(fā)生中可能起著更為重要的作用，尚需進一步研究。

綜上，CRC的發(fā)生與CADM1和DAL-1/4.1B基因表達的異常有關，是一個漸進及多步驟的基因改變過程，且大量研究表明，抑癌基因的突變、缺失和沉默失活在CRC發(fā)病中發(fā)揮重要的作用，如腺瘤樣結腸息肉病易感基因、CRC突變基因及CRC缺失基因等。因此，如何能夠更為徹底地了解基因表達與CRC發(fā)生發(fā)展的關系并以各基因靶點作為出發(fā)點采用分子技術靶向治療CRC值得進一步的探討研究。

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