三種來源細胞因子誘導的殺傷細胞對人食管癌裸鼠原位移植腫瘤的轉移抑制作用

姚文健 白 玉 趙寶生

(新鄉醫學院第一附屬醫院胸外科，河南 衛輝 453100)

我國食管癌5年生存率不足10%〔1〕。影響食管癌患者術后長期生存的主要問題是腫瘤的侵襲和轉移〔2〕。因此，探索食管癌轉移的抑制方法具有重要的研究意義。腫瘤的過繼性免疫治療是腫瘤治療的一個全新領域〔3〕。細胞因子誘導的殺傷(CIK)細胞是一種新型、高效、廣譜殺瘤的免疫活性細胞。輸注CIK細胞的過繼性免疫療法已經成為手術、放療、化療后一種重要的輔助手段，它對于防止腫瘤的復發和轉移具有重要的意義〔4〕。本文分析三種來源CIK細胞對人食管癌裸鼠原位移植瘤生長和轉移的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 臍血為新鄉醫學院第一附屬醫院婦產科提供，均系健康產婦正常分娩的臍帶血；健康人外周血采自本院志愿者；食管癌患者的外周血由本院食管癌患者提供。BALB/C裸鼠由新鄉醫學院動物實驗中心提供，3～4周齡，體重16～22 g，雌雄均可。裸鼠在恒溫25～27℃、恒濕40%～50%、無特殊病原菌(SPF)級飼養室條件下飼養。

1.2試劑及儀器 基因重組人白細胞介素(rhIL)-2(上海華新生物高科技術有限公司)；基因重組人干擾素γ(rhIFN-γ)、CD3 單克隆抗體(McAb)(美國Cytolab公司)；基質金屬蛋白酶(MMP)-9抗體(北京中杉金橋公司)；其他常用試劑及儀器由新鄉醫學院干細胞與再生醫學研究中心提供。

1.3實驗方法

1.3.1CIK細胞的制備 參照美國斯坦福大學CIK細胞培養方法〔5〕。外周血經血細胞分離機采集，經Ficoll液梯度離心分離單個核細胞，按照細胞濃度2×106/ml混懸在無血清培養液中。CIK細胞的誘導：第0天向培養袋中以2 000 U/ml加入rhIFN-γ；置37℃、5%CO2孵箱中孵育。1 d后向培養袋中以1 000 U/ml加入rhIL-2；以50 ng/ml加入CD3MAb；置37℃、5%CO2孵箱中孵育。然后每2～3 d半量換液并補加細胞因子rhIL-2和CD3Mab。培養14 d，即獲得CIK細胞。

1.3.2裸鼠原位移植模型的建立 選擇低分化、淋巴結轉移陽性食管癌組織，標本離體后在去除周圍的纖維組織及壞死部分，用含有青霉素/鏈霉素雙抗(終濃度為100 IU/ml)及10%胎牛血清的RPMI-1640培養液反復沖洗后，用彎剪剪成約1 mm3組織碎塊。裸鼠經0.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射全麻。取2粒組織碎塊包埋于裸鼠右腹部皮下繼續飼養。成瘤后連續鼠間傳代，取傳3代后的瘤塊作為裸小鼠的原位移植瘤塊。裸鼠全麻后取腹正中線切口開腹，在手術顯微鏡下游離食管下段。做3 mm切口深達黏膜下層，經切口將2粒1 mm3瘤塊以10/0無損傷縫合線固定于食管壁黏膜下層。以7/0絲線縫合腹膜，5/0絲線縫皮，繼續飼養。

1.3.3動物實驗 取32只原位移植術后荷瘤裸鼠，隨機分為：食管癌患者自體外周血CIK細胞組、健康人外周血CIK細胞組、臍血CIK細胞組及生理鹽水對照組，每組8只。移植后72 h經尾靜脈給藥，對照組注射生理鹽水，各治療組注射CIK細胞(2×1010/ml)，每天1次，每次0.3 ml，連續20 d。停藥后72 h處死裸鼠。解剖測量瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率=(1-治療組平均移植瘤重/生理鹽水對照組平均移植瘤重)×100%。觀察淋巴結及內臟轉移情況。

1.3.4免疫組織化學染色 采用免疫組化SP法，對各組腫瘤組織應用MMP-9抗體進行免疫組織化學染色。按陽性細胞占所觀察細胞的百分率及著色強度綜合計分行半定量分析。基本不著色者計為0分；著色淡黃色者計為1分；棕黃色者計為2分；棕褐色者計為3分。無陽性細胞計為0分，陽性細胞≤10%計為1分，陽性細胞11%～50%計為2分，陽性細胞51%～75%計為3分，陽性細胞>75%計為4分。染色強度與陽性細胞計分乘積0～2分記為(-)，3～5分為(+)，6～9分為()，10分～12分為()。

1.4統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行t檢驗和Fisher分析。

2 結 果

2.1各組移植瘤瘤重及抑瘤率 與對照組相比，CIK細胞治療組的原位移植瘤重量明顯減輕，且臍血CIK細胞組的瘤重明顯低于另外二種來源的CIK細胞組(P<0.05)。而且其抑瘤率，明顯高于健康人外周血CIK細胞組及食管癌患者自體外周血CIK細胞組(P<0.05)。見表1。

表1 三種來源CIK細胞對人食管癌裸鼠原位移植瘤的抑制作用(n=8，±s)

2.2各組移植瘤的遠處轉移情況 裸鼠解剖發現，對照組裸鼠食管腫瘤發生多發轉移，轉移多見于下段食管旁淋巴結、下肺韌帶淋巴結、胃周淋巴結及肝、肺。與生理鹽水對照組相比，CIK細胞治療組的腫瘤轉移明顯被抑制(P<0.05)。臍血CIK細胞組的轉移率明顯低于另外二種來源的CIK細胞組(P<0.05)。見表2。

表2 各組裸小鼠移植腫瘤的遠處轉移情況(n，n=8)

2.3免疫組織化學染色檢察 免疫組織化學染色可見對照組腫瘤組織中大量細胞MMP-9陽性表達；各治療組腫瘤組織中MMP-9陽性細胞均明顯減少(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 人食管癌裸鼠原位移植模型腫瘤組織中MMP-9的表達情況(n，n=8)

生理鹽水對照組 臍血CIK細胞組

3 討 論

中國是食管癌病死率最高的國家。一直以來，國內多采用食管癌術后輔助放、化療的治療方法，但這會引起消化道反應、抑制骨髓造血、降低患者免疫力等諸多不良反應〔6〕。現在許多學者開始積極探索生物治療、基因靶向治療等新途徑。用免疫活性細胞輸注的過繼免疫療法是腫瘤生物治療的研究熱點之一，此療法不僅是常規抗腫瘤治療的補充，更為晚期不宜手術或無法承受放療、化療不良反應的患者開辟了新的治療途徑〔7〕。CIK細胞是近年來發現的一種新型抗腫瘤細胞，其主要效應細胞表面既有T細胞的表面標志CD3，也有自然殺傷細胞的表面標志CD56，因而兼有T細胞的抗腫瘤活性和自然殺傷細胞的非主要組織相容性復合物(MHC)限制性殺傷腫瘤細胞的特點〔8〕。CIK細胞可由外周血及臍血的單個核細胞誘導培養而成，但目前對不同來源CIK的比較研究較少。本研究分別將食管癌患者自身外周血、健康人外周血、臍血三種來源的CIK細胞輸注于荷瘤裸鼠，顯示CIK細胞治療組能明顯抑制食管癌移植瘤的生長及轉移，且臍血CIK細胞組抑制作用最強。

腫瘤侵襲和轉移是一個多因素、多步驟的生物學過程。在腫瘤轉移過程中，MMPs家族在促進腫瘤細胞遷移、細胞外基質降解和腫瘤遠處轉移等生物學行為中過程中發揮了關鍵作用，尤其是MMP-9被認為不僅可降解細胞外基質蛋白，還可調控血管內皮生長因子(VEGF)，與腫瘤新生血管形成相關，從而在腫瘤侵襲和轉移中發揮重要作用〔9〕。已有研究指出，MMP-9的表達與食管癌的轉移和侵襲有關〔10〕。而在本研究中，我們也觀察到CIK細胞能下調裸鼠食管癌移植瘤中MMP-9的表達。因此，可以認為在CIK細胞抑制食管癌轉移的過程中，抑制MMP-9的表達可能是其重要途徑。

綜上，CIK細胞具有一定的抑制腫瘤生長及轉移的作用，其機制可能與降低腫瘤組織MMP-9表達有關。輸注CIK細胞有望成為新的食管癌治療方法。

4 參考文獻

1蔣光耀.食管癌外科的治療進展〔J〕.重慶醫學，2004；33(2)：161-2.

2曹 峰，王 軍，王 祎.食管癌術后輔助治療研究現狀〔J〕.中華放射腫瘤學雜志，2012；21(5)：483-6.

3曹世龍.腫瘤學新理論與新技術〔M〕.上海:上海科技教育出版社，1997：253- 360.

4肖永雙，溫儒民，鄭俊年，等.IL-15聯合CIK細胞治療裸鼠腎癌移植瘤的實驗研究〔J〕.中國腫瘤，2011；20(3)：231-5.

5Lu PH,Negrin RS.A novel population of expanded human CD3+CD56+cells derived from T cells with potent in vivo antitumor activity in mice with severe combined immunodeficiency〔J〕.J Immunol,1994;153(4):1687-96.

6蔣光耀.食管癌外科的治療進展〔J〕.重慶醫學，2004；33(2)：161-2.

7聶 鑫，劉侃峰，滕少俠.CIK治療惡性腫瘤的研究進展及臨床應用現狀〔J〕.中國實用醫藥，2007；2(7)：106-7.

8張志凱，祁巖超.健康人和腫瘤患者CIK細胞的生物學特性〔J〕.中國熱帶醫學，2009；9(2)：253-5.

9Bergers G,Brekken R,McMahon G,etal.Matrix metalloproteinase-9 triggers the angiogenic switch during carcinogenesis〔J〕.Nat Cell Biol,2000;2(10):737-44.

10郭 穎，王琳冬，郝秀輕，等.基質金屬蛋白酶-2和-9在食管鱗狀細胞癌中的過表達〔J〕.中國老年學雜志，2011；31(3)：389-91.