亞硒酸鈉對結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞AMPK/mTOR通路活化及凋亡的影響

駱 新 石勁松 盧 偉 王 忠

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

硒化合物具有抑制腫瘤發(fā)生的化學(xué)預(yù)防作用，血硒濃度達(dá)到113 ng/ml時具有預(yù)防癌癥的效果〔1〕，血硒濃度超過120 ng/ml能有效降低癌癥風(fēng)險〔2〕，這些結(jié)論對結(jié)腸癌的預(yù)防有指導(dǎo)意義〔3,4〕。然而，關(guān)于硒化合物的抗癌機(jī)制，尤其是其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制目前尚不清楚。激活的蛋白質(zhì)激酶(AMP)在能量代謝和凋亡的調(diào)控中起到重要的作用。在細(xì)胞內(nèi)AMPK被激活后可對凋亡關(guān)鍵調(diào)控分子哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的磷酸化水平進(jìn)行調(diào)控，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究主要針對AMPK/mTOR通路在亞硒酸鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞凋亡中所起的作用進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1材料 結(jié)直腸癌HT-29細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心。亞硒酸鈉購自Sigma公司；AMPKα抗體、p-AMPK抗體和p-mTOR抗體購自Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG購自Santa Cruz公司；轉(zhuǎn)染試劑購自Lonza公司；AMPK特異siRNAs購自Qiagen公司；AnnexinV/PI染色試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1HT-29細(xì)胞培養(yǎng) HT-29細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)基內(nèi)，37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。細(xì)胞傳代至對數(shù)生長期開始實驗。

1.2.2細(xì)胞處理 采用0、3、5、10和20 μmol/L的亞硒酸鈉及20 μmol/L的亞硒酸鈉處理HT-29細(xì)胞0、3、6、12和24 h。采用1 mmol/L的AMPKα亞基特異激活劑AICAR激活HT-29細(xì)胞中的AMPK通路。敲低HT-29細(xì)胞中AMPK表達(dá)采用的siRNAs濃度為300 pmol，有效敲低時間為72 h。

1.2.3細(xì)胞總蛋白提取 實驗用細(xì)胞以冰PBS洗滌2次，400 r/min離心5 min；棄去上清，細(xì)胞沉淀中加入蛋白酶磷酸酶抑制劑和100 μl CytoBuster 蛋白提取試劑，高速渦旋細(xì)胞裂解混合物25 s，室溫放置15 min；4℃，12 000 r/min 離心15 min；所得上清部分即細(xì)胞總蛋白，除留部分樣品檢測蛋白濃度外，其余分裝15 μl/管，-80°C 凍存。

1.2.4BCA法測定蛋白濃度 按說明書倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品BSA；按體積比為50∶1 混合BCA 試劑A和試劑B，即為工作液；96孔板中每孔加入200 μl工作液，隨后加入25 μl倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品，每種樣品設(shè)置3復(fù)孔。37℃ 孵育30 min；振蕩器短暫混勻后在波長562 nm 處測定OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的光密度值和濃度梯度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣品的OD 值推算各蛋白樣品濃度。

1.2.5Western印跡 等量的提取蛋白經(jīng)8%～10% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠分離后，半干轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，以含5% BSA 的TBST室溫封閉1 h，加入一抗4℃過夜孵育。第二天用0.1% TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入相應(yīng)HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。0.1%TBST 洗膜后，硝酸纖維素膜以Supersignal West Femto/Pico HRP敏感化學(xué)發(fā)光底物對條帶進(jìn)行顯色。Actin為內(nèi)參。所有實驗至少重復(fù)3次。

1.2.6凋亡率檢測 收集細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，1% BSA PBS洗滌1次。用100 μl Binding緩沖液將細(xì)胞重懸，加入2 μl Annexin V染料和0.1 μl PI染料，避光15 min，流式細(xì)胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS15.0軟件采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1亞硒酸鈉對HT-29細(xì)胞中AMPK及mTOR蛋白磷酸化水平的作用 隨著亞硒酸鈉濃度的升高和處理時間的延長，HT-29細(xì)胞中AMPK蛋白磷酸化水平逐漸升高，mTOR蛋白磷酸化水平逐漸降低(圖1)。

2.2AICAR對mTOR磷酸化水平及HT-29細(xì)胞凋亡的影響 與對照組相比，亞硒酸鈉和AICAR可顯著激活HT-29細(xì)胞內(nèi)的AMPK通路，抑制mTOR通路(圖2A)。亞硒酸鈉和AICAR處理HT-29細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率顯著升高(圖2B)。

2.3敲低AMPK蛋白表達(dá)對亞硒酸鈉處理HT-29細(xì)胞中mTOR磷酸化水平及細(xì)胞凋亡的影響 與亞硒酸鈉處理組相比，敲低HT-29細(xì)胞中AMPK表達(dá)后，細(xì)胞中mTOR磷酸化水平顯著升高(圖3A)。與單獨亞硒酸鈉處理組相比，敲低HT-29細(xì)胞中AMPK表達(dá)后，亞硒酸鈉誘導(dǎo)的HT-29細(xì)胞凋亡率顯著降低(圖3B)。

A. 不同濃度亞硒酸鈉處理HT-29細(xì)胞；B. 20 μmol/L亞硒酸鈉處理HT-29細(xì)胞不同時間；Con：對照組

與對照組比較：1)P<0.01；Con:對照組，se:亞硒酸鈉組，與對照組比較：1)P<0.01

與亞硒酸鈉組比較：1)P<0.01；Con：對照組；se:亞硒酸鈉組；si:siMAPK組：si+se:亞硒酸鈉+siMAPK組

3 討 論

近年，越來越多的證據(jù)支持硒化合物與經(jīng)典的化療或放療方案連用不僅具有保護(hù)正常細(xì)胞的作用，并且能夠達(dá)到聯(lián)合化療的作用；Husbeck等〔5〕報道亞硒酸鈉能促進(jìn)射線誘導(dǎo)的前列腺癌殺傷作用；Hu等〔6〕發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉能促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)的前列腺癌殺傷作用；Li等〔7,8〕報道Methulseleninic acid能通過上調(diào)Bim的表達(dá)促進(jìn)Doxorubicin誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞殺傷作用。

AMPK是一種保守的異源三聚體蛋白質(zhì)激酶，細(xì)胞內(nèi)的AMPK被激活后，即刻產(chǎn)生急性效應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，影響細(xì)胞的生物學(xué)行為〔9〕；同時，AMPK的激活可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬〔10,11〕。mTOR是一種絲/蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，可接受并整合細(xì)胞內(nèi)外的各種刺激，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長增殖、存活、自噬、凋亡等生理過程〔12〕。mTOR被認(rèn)為是AMPK下游分子，AMPK通過調(diào)控mTOR磷酸化水平，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)隨著亞硒酸鈉濃度的升高和處理時間的延長，HT-29細(xì)胞中AMPK的磷酸化水平逐漸升高，而mTOR的磷酸化水平逐漸降低。用AMPKα亞基特異激活劑AICAR激活HT-29細(xì)胞中的AMPK通路，可顯著抑制HT-29細(xì)胞中mTOR的磷酸化，這一結(jié)果與亞硒酸鈉單獨處理HT-29細(xì)胞結(jié)果相似，且AICAR和亞硒酸鈉均可促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。AICAR和亞硒酸鈉作用的相似性提示亞硒酸鈉可能通過激活A(yù)MPK，進(jìn)而抑制mTOR，從而促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。敲低HT-29細(xì)胞中AMPK表達(dá)后，以亞硒酸鈉處理HT-29細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)HT-29細(xì)胞中mTOR的磷酸化水平明顯增加，表明AMPK為mTOR的上游分子，且AMPK對mTOR存在抑制作用。敲低HT-29細(xì)胞中AMPK表達(dá)后，亞硒酸鈉處理HT-29細(xì)胞的凋亡率亦顯著降低。綜上所述，本研究證實亞硒酸鈉可通過激活HT-29細(xì)胞中的AMPK通路，進(jìn)而抑制mTOR通路的活化，從而促進(jìn)HT-29細(xì)胞凋亡。

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