豬小腸黏膜下層海綿的三維重建、表面修飾和細胞黏附性

田 偉 王效杰

(沈陽醫(yī)學院解剖教研室，遼寧 沈陽 110034)

細胞與材料的相互作用是組織工程研究的重要內(nèi)容〔1〕，種子細胞的功能有賴于細胞外基質(zhì)的存在〔2〕。目前，皮膚組織工程研究的熱點之一在于尋找理想的支架材料。因為其不僅影響種子細胞的生物學特性和培養(yǎng)效率，而且決定組織工程皮膚移植后能否適應(yīng)受體并與之結(jié)合，實現(xiàn)修復(fù)皮膚缺損的目的。小腸黏膜下層(SIS)是近年來利用物理和化學的方法處理而得到的無細胞的天然細胞外基質(zhì)〔3，4〕，其結(jié)構(gòu)與皮膚十分相似，但是其孔徑率和孔徑大小并不利于種子細胞長入。本實驗利用化學-物理-材料力學的方法對SIS進行改建，以骨髓基質(zhì)干細胞為種子細胞，體外進行聯(lián)合培養(yǎng)，通過觀察骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)在SIS上的生長情況，確定SIS的生物相容性，為利用SIS作為支架材料構(gòu)建組織工程皮膚提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗材料 Wistar大鼠10只，雌雄不限。豬小腸由河北省薊州肉食加工公司購買。胃蛋白酶和1-Ethyl-3-EDC由sigma公司購買。TritonX- 100由美國圣路易斯化工有限公司購買

1.2實驗方法

1.2.1豬SIS的準備 小腸用清水沖洗干凈后, 采用文獻2的方法處理得到無細胞的SIS。

1.2.2豬SIS海綿的制備 將準備好的SIS 用剪刀剪成1 cm2大小的組織塊，放入含有0.2%的胃蛋白酶3%的乙酸水溶液，SIS以不同的1～4wt%濃度配比，在37℃磁力攪拌器中攪拌72 h，等到SIS充分溶解以后，倒入培養(yǎng)皿中，冷凍24 h后，在冷凍干燥機中24 h，將所得的SIS海綿剪成直徑在1 cm圓形，放入12孔的培養(yǎng)板中，分成三組，用含有50、100和150 mmol/L EDC的體積比為95∶5酒精水溶液進行交聯(lián)24 h，然后取出在40℃的水浴中反復(fù)沖洗，取出未反應(yīng)的SIS,再次冷凍干燥，并使用環(huán)氧乙烷消毒(沈陽市中心醫(yī)院)，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?〕。

1.2.3豬SIS海綿的形態(tài)學觀察 (1)蘇木素-伊紅(HE)染色：取SIS海綿，大小1 cm×2 cm，石蠟常規(guī)切片，做HE染色，以SIS為對照。(2)掃描電鏡觀察： SIS海綿置于預(yù)冷的2.5%戊二醛溶液內(nèi)，浸泡12 h，取出樣品塊放入0.1 mol/L磷酸緩沖液(PBS)(pH7.2)中過夜，系列梯度酒精脫水，醋酸異戊酯置換，二氧化碳臨界點干燥，真空噴金，JSM-T300掃描電鏡觀察并攝片，以SIS為對照。(3)孔徑大小的測量：取HE染色的石蠟切片，共9組，每組隨機抽取10個切片，每個切片4個視野，用Luzex-F實時圖像分析系統(tǒng)進行分析，計算孔徑大小及孔徑率，以SIS為對照。(4)吸水率的測定：用20 ml去離子水浸泡0.05 g的100 nm的1wt%～4wt%的SIS海綿 ,每組5個樣品，每24 h將多余的水分吸去，直至燒杯中無肉眼可以鑒別的水分，測量浸泡前后重量的變化，連續(xù)5 d，計算水的吸收能力由方程W =( F- 0.05/0.05)×100%,其中，W是SIS海綿的吸水率， F是浸泡后SIS海綿的重量，然后計算平均值。(5)SIS海綿降解率的測定：將一定質(zhì)量的支架材料浸入在含0.1%胃蛋白酶的3%乙酸溶液中，60 min后，待材料吸收了充分的溶液后稱重記為W1，放置在37℃水浴振蕩器中，維持溫度并同時對其震蕩，每隔24 h，取出支架材料，用濾紙將材料表面的液體擦干，稱重記為W2，支架材料的降解率為：D= (W1-W2)/W1×100%，每個樣品測3個樣，求其平均值。

1.2.4BMSCs復(fù)合SIS海綿的形態(tài)學觀察 (1)BMSCs的培養(yǎng)：取昆明小白鼠20只，雌雄不限，1月齡，體重約18 g，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，無菌條件下暴露股骨，去除干凈附帶的肌肉和骨膜，取中段股骨，用加入肝素的PBS液進行沖洗，沖洗液加入10 ml離心管中1 000 r/min 10 min離心，棄上清，加3 ml DMEM培養(yǎng)基(LG)進行吹打，接種于20 ml培養(yǎng)瓶，加入5 ml DMEM培養(yǎng)基，置于5%CO2，37℃，飽和濕度的CO2孵箱中進行培養(yǎng)，2 d后進行首次換液以去除混雜的血細胞和單核細胞，以后每2天換液，每日倒置鏡下觀察，2 w后細胞長滿單層，進行傳代培養(yǎng)，取一部分細胞進行堿性磷酸酶染色及光、電鏡觀察。(2)BMSCs和SIS海綿的聯(lián)合培養(yǎng)、取第2代的BMSCs，將細胞濃度調(diào)整為1.1×104/ml,加入預(yù)先準備的12孔培養(yǎng)板中，讓每孔中SIS海綿充分潤濕，置于5%CO2，37℃飽和濕度的CO2孵箱中進行培養(yǎng)， 6 h后更換培養(yǎng)液，以后每2 d換1次液，聯(lián)合培養(yǎng)1、2、3 w后，分別將復(fù)合物取出。部分以10%甲醛固定，石蠟包埋，切片，行HE染色。部分標本以2.5%戊二醛固定，做掃描電鏡觀察。

1.3統(tǒng)計學分析 統(tǒng)計學處理：應(yīng)用SPSS11，軟件進行分析，差異顯著性采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1肉眼、HE染色 肉眼觀察SSIS呈海綿狀，韌性強，光鏡下顯示呈蜂窩狀，結(jié)構(gòu)較規(guī)整，沒有極性，孔隙分布均勻，內(nèi)部和外部的結(jié)構(gòu)一致，沒有分層現(xiàn)象。見圖1，圖2。

2.2掃描電鏡觀察 SIS濃度升高，出現(xiàn)了孔徑大小和密度的變化，在2wt%時孔徑大小約為100～150 μm，但是隨著SIS濃度增加，孔徑逐漸下降，而且結(jié)構(gòu)出現(xiàn)松散的現(xiàn)象。見圖3。

2.3SIS海綿孔徑大小的測量 冷凍干燥法制備的SIS海綿為多孔連通性分布，1wt%組的平均孔徑為100～150 μm，而2wt%組支架平均孔徑為150～200 μm,其他各組的孔徑在逐漸下降。此外，以2wt%組的支架，各層之間的連接多為較細的似纖維的結(jié)構(gòu)，造成整個支架的內(nèi)部結(jié)構(gòu)較粗糙，而對于以1wt%組的支架，各層之間的連接多光滑，材料內(nèi)部的相對粗糙度較小，不利于細胞的黏附，而且1wt%、2wt%組和3wt%、4wt%組的差異顯著(P<0.05)。見表1 。

圖1 SIS海綿和單層SIS膜的比較

圖2 SIS海綿的HE染色(以SIS對比,×40)

圖3 100 mmol/L組1wt%SIS海綿的電鏡特點(×500)

表1 不同濃度的EDC 100 nm的SIS海綿的孔徑短軸大小的兩兩比較

2.4吸水率的測定 在去離子水中浸泡1～5 d的100 nm EDC不同的質(zhì)量分數(shù)的SIS海綿組，不同濃度的SIS海綿中，1wt%的吸水能力比2wt%高出均2倍，吸水率均數(shù)為0.654 1 vs 0.485 4；但是其他兩組的吸水能力和2wt%的區(qū)別不是特別明顯，3wt%、4wt%組吸水率均數(shù)分別為0.366 8、0.331 7。結(jié)構(gòu)顯示，1wt%的結(jié)構(gòu)更加利于水分的流動和變化，而且和PBS對比沒有大的區(qū)別，但是4wt%組吸水力已經(jīng)沒有明顯的改變。

2.5SIS海綿降解率的測定 各組材料從外形上看，5 d時，每組支架都有不同程度的降解，1wt%、2wt%組均保持了原有的外觀，但是其他兩組，尤其4wt%組變化明顯，各組材料1wt%組與其他3組比較差異顯著(P<0.05)；各組支架在第2天時降解速度較快，特別是按4wt%比例制備的材料，在第5天就已降解約30%，其余三組各組間進行比較差異顯著 (P<0.05)，支架材料的降解率隨含SIS海綿比例的增加，降解速度加快。1wt%組每周約降解14%，2wt%平均降解15%， 3 wt%平均為18%，1∶4平均為30%，表2。

2.6BMSCs的聯(lián)合培養(yǎng)

表2 不同質(zhì)量濃度的SIS海綿的殘余重量均數(shù)

2.6.1細胞形態(tài) 剛接種時，骨髓細胞懸液中的細胞呈圓形，大小不一，不能辨認細胞核；2 d后，細胞開始貼壁，形態(tài)不一，以多角形為主，其次還有梭形，三角形細胞，換液后懸浮的血細胞逐漸被清除，大約2次換液后基本完成純化過程。大約7 d后形成細胞集落，無接觸抑制，大部分呈不規(guī)則形，層次不清，2 w后細胞長滿全層。見圖4A。

2.6.2細胞鑒定 取1 w的細胞傳代，將多聚賴氨酸包被的載玻片放入培養(yǎng)瓶中，待鋪滿后，取出，鈣鈷法堿性磷酸酶染色呈弱陽性。掃描電鏡觀察，小鼠BMSCs以星形和多角形為主，這和光鏡的觀察結(jié)果一致。見圖4B，圖4C。

2.6.3BMSCs和SIS海綿的聯(lián)合培養(yǎng) 在聯(lián)合培養(yǎng)中，第1天細胞在不同的海綿中表現(xiàn)都是圓形，未見有明顯的變形和貼服，光鏡下，可見細胞在支架內(nèi)分布均勻，大小一致，細胞局部出現(xiàn)集中現(xiàn)象和重疊分布，電鏡可以明顯發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)出了許多凸起和接觸。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，細胞的形態(tài)由圓形變成了星型和長梭型，尤其以孔隙的附近，重疊的現(xiàn)象比較多見。電鏡下，細胞的形態(tài)出現(xiàn)鋪路石樣的改變，將支架表面大部分覆蓋，而且在周圍出現(xiàn)了大量顆粒樣物質(zhì)，尤其在細胞集中的位置多見，在不同SIS濃度的支架材料中，隨著濃度的增加，細胞的變形特點逐漸在培養(yǎng)中變得不明顯，以2wt%組明顯，而且細胞的集中現(xiàn)象和細胞周圍的顆粒現(xiàn)象也逐漸消失或變得非常微弱。在由圓形變?yōu)殚L梭形的過稱中，1wt%組的細胞變形比較快和完整，但隨著濃度的增加，變形的特點和數(shù)量在減弱。在孔隙的位置，細胞的形態(tài)比較大，而且外形接近長梭型，數(shù)目比較多，而孔隙的周圍細胞的形態(tài)比較小，類似于圓盤形，數(shù)目較少。見圖4D。

A

B

C

D

A：小鼠BMSCs 2 w時的相差觀察(×100);B:小鼠BMSCs鈣鈷法堿性磷酸酶染色呈弱陽性(×100);C:小鼠BMSCs掃描電鏡(×1 500);D:小鼠BMSCs在SIS海綿表面生長(×1 500)

圖4BMSCs聯(lián)合培養(yǎng)后細胞形態(tài)

3 討 論

組織工程材料適宜的孔徑以及孔徑分布，對于的細胞生長和物質(zhì)能量交換十分重要，并且材料的空隙率也會影響吸收過程 ,此外，將會利于干細胞在其上黏附、增殖和分化〔6,7〕。本研究通過胃蛋白酶-EDC冷凍干燥法制備了SIS海綿支架，構(gòu)建出仿生的人工皮膚復(fù)合基質(zhì)，進而對其孔隙率、吸水率、干細胞在其上的黏附性能和分布等進行了考察，以確定所制備的支架材料作為組織工程皮膚支架的可行性。

隨著SIS溶液濃度的升高，支架的密度以及孔徑都有所增大，但空隙率卻有所降低。這主要是由于隨著SIS溶液濃度的升高，支架材料孔壁加厚，再加上酰胺基密度升高造成基團排斥力增大，從而使支架的密度和孔徑升高，但由于大部分體積被SIS本身占據(jù)，孔隙率卻有所下降。

SIS主要呈線性結(jié)構(gòu)，強度較弱，通常需要對其進行交聯(lián)，使其形成三維的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，以增強其機械強度〔8〕。本研究嘗試普遍選用的低毒無污染的交聯(lián)劑EDC，考察其對整個支架材料性能的影響。

理想的組織工程三維支架應(yīng)該模擬體內(nèi)細胞生存的微環(huán)境，誘導干細胞與其密切接觸并使其與材料很好的黏附，并最終在其上伸展、增殖以及分化〔9〕。本文制備的SIS海綿，就是以此理念構(gòu)建的具有良好細胞相容性的人工基質(zhì)材料。在此材料中，膠原蛋白海綿為細胞提供了一定密度的正電荷，通過靜電作用對細胞膜上帶有負電荷的細胞更有親和力〔10〕。此外，BMSCs包面帶有大量的負電荷，同時，膠原蛋白又是細胞生存所必需的細胞外基質(zhì)，所以，本研究所構(gòu)建的經(jīng)表面修飾的SIS海綿與細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能相類似，可以維持BMSCs黏附、伸展和增殖，可作為組織工程皮膚較理想的支架。

4 參考文獻

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