肌球蛋白輕鏈激酶對大鼠平滑肌細胞增殖的影響

李德來 鄧為民 李宏釗

(天津醫科大學基礎醫學院，天津 300070)

肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)高度表達于平滑肌細胞，是平滑肌細胞收縮調節的限速蛋白。在相應信號機制激動下，MLCK被磷酸化后激活肌球蛋白球部的ATP酶，觸發ATP水解為肌細胞收縮提供能量，從而導致肌肉收縮。此外，MLCK還可以通過非激酶方式觸發平滑肌收縮。有研究表明MLCK可對腫瘤細胞增殖調控起重要作用，近年研究又表明MLCK在慢性缺氧導致的肺血管平滑肌收縮中起重要作用〔1〕，但MLCK對平滑肌細胞增殖的影響目前尚不清楚。本研究旨在通過研究闡明MLCK在平滑肌細胞增殖中的作用及其可能涉及的機制。

1 材料和方法

1.1材料 新生SD大鼠(約4周齡)購自貴州大學實驗動物中心。DMEM高糖培養基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶〔含0.5%乙二胺四乙酸(EDTA)〕及磷酸鹽緩沖液(PBS)購自Gibico公司；8肽膽囊收縮素(CCK-8)細胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁化學研究所(Dojindo)；兔抗大鼠α-肌動蛋白單克隆抗體購自Abcam公司；真核表達及病毒包裝所需元件購自Addgene，引物及shRNA片斷由Invitrogen公司負責合成；RNA抽提試劑Trizol及PCR檢測試劑均購自日本寶生物公司。

1.2肺動脈血管平滑肌細胞(VMSC)培養 處死大鼠后，以75%酒精擦拭大鼠以消毒，分離并取出肺動脈后將之置于無菌PBS內，沖凈血液并去除結締組織，最后將肺動脈剪成1 mm3左右大小組織塊置于培養瓶內于37℃孵育2 h。取出培養瓶并加入含10% FBS及1%雙抗的DMEM培養基，再次置于細胞培養箱內培養，每3～5天換液1次，直至細胞從組織塊周圍長出。最后用0.25%胰蛋白酶消化細胞，擴大培養。使用平滑肌α-肌動蛋白染色并鑒定其純度。

1.3載體構建及病毒包裝 為從基因水平上調控MLCK表達，本研究擬采用病毒介導MLCK過表達或shRNA干擾方法進行。使用高保真PCR酶擴增大鼠MLCK編碼序列(CDS序列)全長，并于起始啟動子前添加Kozak序列以增強其轉錄，將擴增產物經酶切后連接至慢病毒表達載體pCDH-CMV-MCS-EF1α-copGFP，最后使用psPAX2及pMD2.G包裝慢病毒后轉染VMSC，以PCR方法檢測MLCK上調情況。全部引物見表1。將shRNA溶解并置20 ρmol于20 μl退火緩沖液(10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA及200 mmol/L NaCl)中，以PCR儀以1為單位進行梯度降溫，每個溫度維持1 min，最后取出產物即為退火完全的shRNA，經非變性聚丙稀酰胺凝膠(PAGE)瓊脂糖電泳證實該方法可將shRNA徹底退火成雙鏈。將上述退火后的shRNA與酶切后的miRZip載體連接，篩選出正確重組子后按上述方法包裝慢病毒并轉導VSMC。

1.4VSMC增殖檢測 使用內皮素(ET)-1誘導VSMC增殖，以CCK-8細胞增殖試劑盒檢測不同MLCK表達水平對VSMC增殖的影響，觀察MLCK表達水平對VSMC增殖的影響。

1.5統計學分析 計量資料組間比較采用t檢驗。

表1 本研究中所使用PCR引物及shRNA序列

2 結 果

2.1慢毒包裝及基因轉導效果 本研究過程中已使全部VSMC帶上外源基因(圖1)。RT-qPCR結果及Western印跡結果亦顯示MLCK被顯著上調或抑制(圖2)。

2.2MLCK水平改變對VSMC增殖和ETA-R的影響及Rho激酶在其中的作用 過表達MLCK可直接導致VSMC增殖能力增強，而且還進一步增殖被ET-1刺激的VSMC增殖；而抑制MLCK可減弱VSMC增殖能力并抑制ET-1導致的VSMC增殖。見圖2。RT-qPCR(PVSMC-miRNA Zip組：0.83±0.21，PVSMC-shRNA組：0.27±0.03，P<0.05)及Western印跡(PVSMC-COPgfp組：0.78±0.17，PVSMC-MLCK組：15.08±2.65，P<0.05)結果均顯示MLCK表達升高可導致VSMC ETA-R升高，ET-1刺激下可加劇這種改變；而下調MLCK表達可抑制ETA-R表達，并抑制ET-1帶來的ETA-R表達水平增加。

2.3MLCK對ETA-R的作用與Rho激酶作用的關系 Rho激酶抑制劑Fasudil可減弱MLCK及ET-1升ETA-R的作用。ET-1、ET-1+MLCK、ET-1+shRNA、ET-1+MLCK+FASUDIL組OD值分別為0.71±0.14，0.89±0.16，0.34±0.04，0.58±0.07，見圖3。

圖1 PVSMC明場(A)和PVSMC-pCDH-MLCK-copGFP熒光(B)

A.免疫印跡顯示MLCK被顯著上調或下調；B.RT-qPCR結果與免疫印跡結果一致

圖3 MLCK對PVSMC表達ETA-R增殖的作用

3 討 論

本研究采用慢病毒操縱基因表達的方法，證實了MLCK在VSMC增殖中的作用。結果表明，MLCK表達升高可促進VSMC增殖及上調ETA-R表達水平，進一步研究還表明，MLCK的這種作用可能是通過其對Rho激酶的激活實現的。

肺動脈高壓的重要發生機制之一是平滑肌收縮。MLCK在平滑肌收縮中的作用已有多量報道。經典理論認為，MLCK通過使用MLC磷酸化觸發局部Mg2+-ATP酶活性，從而引發肌肉收縮〔2〕。在隨后針對MLCK研究歷程中，學者發現MLCK以非激酶方式調節平滑肌收縮〔3〕。但無論MLCK以何種方式進行調節及發揮作用，結果均一致認為隨著MLCK增加，肌絲運動速度增強，平滑肌收縮增強。

在肺動脈高壓中，除平滑肌收縮外，平滑肌增殖參與血管重塑及平滑肌對縮血管物質的反應也是決定肺動脈高壓進展的重要因素〔4〕。然而，盡管MLCK在平滑肌收縮研究中已得到充分研究，其在平滑肌增殖中的作用至今尚未見報道。本研究結果發現MLCK可促進VSMC增殖并促進ETA-R表達。鑒于VSMC增殖及ET-1在肺動脈高壓中的重要作用，本研究結果提供了MLCK調節肺動脈高壓的機制，可能為肺動脈高壓防治帶來更多思路。

Rho激酶在肺動脈高壓中的作用日益得到重視，大量研究認為Rho激酶激動劑對肺動脈高壓有益，且目前已成為肺動脈高壓干預靶點之一〔5〕，且MLCK與Rho在平滑肌收縮中的相互作用已被報道〔6〕。本研究結果顯示，Rho激酶抑制劑至少可部分抵消MLCK的激活VSMC增殖及增強ETA-R表達作用。盡管其機制未明，但這提示Rho激酶這一已在肺動脈高壓中得到證實的關鍵酶可能參與MLCK調節肺動脈高壓的機制中。目前，尚無證據顯示MLCK能調節Rho激酶活性；同時，鑒于MLCK及Rho激酶對平滑肌收縮作用的同向性，Rho激酶作為一放大效應分子而非MLCK直接調節目標的可能性仍不能排除，其具體機制仍有待進一步證實提供更多證據。

4 參考文獻

1Jernigan NL，Walker BR，Resta TC.Reactive oxygen species mediate RhoA/Rho kinase-induced Ca2+sensitization in pulmonary vascular smooth muscle following chronic hypoxia〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2008；295(3)：L515-29.

2Kirschstein T，Protzel C，Porath K，etal.Age-dependent contribution of Rho kinase in carbachol-induced contraction of human detrusor smooth muscle in vitro〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2014;35(1):274-81.

3梁明麗，崔 穎，呂廣艷，等.肌球蛋白輕鏈激酶非激酶活性調節磷酸化肌球蛋白ATP酶活性及肌絲運動〔J〕.生物化學與生物物理進展，2008；35(1)：91-6.

4Karoor V，Oka M，Walchak SJ，etal.Neprilysin regulates pulmonary artery smooth muscle cell phenotype through a platelet-derived growth factor receptor-dependent mechanism〔J〕.Hypertension，2013；61(4)：921-30.

5Mathew R.Pulmonary hypertension：current therapy and future prospects〔J〕.Cardiovasc Hematol Agents Med Chem，2011;9(3)：165-82.

6Kogata N，Tribe RM，Fassler R，etal.Integrin-linked kinase controls vascular wall formation by negatively regulating Rho/ROCK-mediated vascular smooth muscle cell contraction〔J〕.Genes Dev，2009；23(19)：2278-83.