高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的基因篩選

王 理 文西年 文大成 依里牙爾·依里哈木 許新才 高 華 張文斌

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，新疆 烏魯木齊 830000)

大腸癌是我國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，肝臟是大腸癌最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)移部位，已有研究認(rèn)為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移涉及原位癌細(xì)胞血管侵入、肝血管內(nèi)皮細(xì)胞附著，以及肝實(shí)質(zhì)浸潤(rùn)種植，從而導(dǎo)致肝轉(zhuǎn)移灶的形成。其可能機(jī)制包括黏附分子、血管新生因子、細(xì)胞外金屬基質(zhì)蛋白酶等多種基因表達(dá)異常〔1〕。更加深入理解結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的病理分子機(jī)制以及尋求新的治療靶點(diǎn)，從而針對(duì)性開展臨床試驗(yàn)是工作目標(biāo)。本研究旨在建立一種新的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的模型，并通過(guò)體內(nèi)及體外試驗(yàn)篩選出侵襲能力高、轉(zhuǎn)移能力高的細(xì)胞株。

1 材料與方法

1.1試劑及器材 四甲基耦氮唑鹽(MTT)；二甲基亞砜(DMSO，美國(guó)Sigma公司)；RPMI 1640(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)。二氧化碳孵箱(美國(guó)NAPCO公司)；超凈工作臺(tái)；離心機(jī)；ELISA酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；細(xì)胞培養(yǎng)板(Millipore公司)；無(wú)菌濾器(美國(guó)Costar公司)；無(wú)菌手術(shù)器械。

1.2細(xì)胞系及動(dòng)物 結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所。6～8周齡的BALB/c小鼠，雄性，體重18～22 g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(新)2003-0001〕。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 解凍人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞株，用生理鹽水洗滌兩次，接種于含10%新生牛血清(56℃滅活30 min)的RPMI 1640培養(yǎng)液中,在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底80%以上時(shí)，酶消化備用。

1.3.2結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株的篩選 結(jié)腸癌HT29細(xì)胞懸液，用生理鹽水洗滌兩次，選用6～8周齡BALB/c小鼠，在腋?jìng)?cè)皮下接種前述細(xì)胞，待皮下瘤生長(zhǎng)到約1.5 cm3處死小鼠,完整剝離皮下轉(zhuǎn)移瘤組織作為移植源材，重復(fù)3次，最后得到的皮下移植瘤細(xì)胞即為高轉(zhuǎn)移、高侵襲性結(jié)腸癌細(xì)胞。

1.3.3建立高轉(zhuǎn)移、高侵襲性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型 6～8周齡的BALB/c小鼠，取腹部正中切口,長(zhǎng)約10～15 mm,充分暴露盲腸后，用無(wú)齒鑷將損傷腸管向內(nèi)推壓，使局部腸壁形成凹陷，取上述皮下移植所得腫瘤組織塊置于漿膜與漿膜下層，使用醫(yī)用膠固定于腸壁,關(guān)閉腹腔。術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境下建立高侵襲性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的模型。

1.3.4提取RNA及擴(kuò)增 用冰冷PBS液洗滌細(xì)胞兩次，Trizol一步法提取總RNA，加入Takara公司Trizol 試劑1 ml，靜置15 min，小滴管吹打使細(xì)胞完全裂解，移入1.5 ml EP管內(nèi)，再入200 μl氯仿，劇烈震蕩混勻30 s，靜置10 min，分層，上層水相，下層酚相。而后4℃15 000 r/min離心15 min后，上層為水相。將上層液體移入另一新EP管內(nèi)，約400～500 μl，新EP管內(nèi)加入等量異丙醇溶液，充分混勻，靜置10 min后4℃ 15 000 r/min離心10 min，管底可見(jiàn)RNA沉淀。棄上清，留RNA沉淀，加入4℃ 75%乙醇漂洗兩次，吸干液體后干燥約20 min，待沉淀為半透明狀時(shí)，用20 μl DEPC水溶解RNA沉淀。紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA產(chǎn)物濃度和純度。非變性電泳A260/A280判斷RNA的純度和完整性以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。而后用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) 試劑盒合成cDNA。

1.3.5cDNA芯片 采用RNA Fluorescence Labeling Core Kit(M-MLV Version，Takara) 芯片技術(shù)〔2〕。10 μl逆轉(zhuǎn)錄體系中加入4 μg細(xì)胞總RNA，Cy3/Cy5-dUTP法分別標(biāo)記親代細(xì)胞和高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的RNA，純化后乙醇沉淀，將標(biāo)記探針混合溶解到10 μl雜交液中(含有50%甲酰胺，50 mmol/L DTT，5×Denhardt液，5%硫酸葡聚糖，4×SSC，0.2%SDS)。用人癌基因芯片〔Human Cancer Chipversion 4.0 (Takara，Japan)〕做cDNA雜交。95℃2 min將探針變性，后放冰上，完全冷卻后15 000 r/min離心10 min取上清液置芯片上，覆蓋玻片后置于雜交艙65℃ 16 h。洗滌依次為：4×SSC/0.2%SDS溶液55℃30 min×2次；2×SSC/0.2%SDS溶液65℃5 min×1次；0.05×SSC室溫5 min×1次。基因芯片放入50 ml離心管3 000 r/min離心2 min，將其表面水分甩干。用Agilent掃描儀掃描，用Imagene3.0軟件(Biodiscovery,Inc.)圖像分析。計(jì)算2種熒光Cy3/Cy5信號(hào)強(qiáng)度的比值。定義高轉(zhuǎn)移性相關(guān)基因標(biāo)準(zhǔn)：①上調(diào)基因：高轉(zhuǎn)移性組Cy3/ Cy5>2.0，Cy5>500，且與親代組細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；②下調(diào)基因：高轉(zhuǎn)移性組Cy3/Cy5 <0.5，Cy3>500，且與親代組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

1.3.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR鑒定 基因引物序列見(jiàn)表1。采用StepOne PCR儀和TaqMan SYBR Green I(Takara)進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。在差異表達(dá)基因中選擇6個(gè)基因進(jìn)行定量驗(yàn)證，3個(gè)上調(diào)基因，3個(gè)下調(diào)基因， GAPDH設(shè)為內(nèi)參。20 μl qPCR反應(yīng)體系(TaqMan SYBR Green I，Takara公司試劑)。每樣品設(shè)三副孔，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)空白孔和陰性對(duì)照孔。

表1 7個(gè)基因的引物序列

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1差異表達(dá)基因結(jié)果 高轉(zhuǎn)移性組與親代組相比共36個(gè)基因差異表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，其中表達(dá)上調(diào)基因有20個(gè)，表達(dá)下調(diào)的基因有16個(gè)。兩組間表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因的Cy3/Cy5比值波動(dòng)于0.25～3.16。跟據(jù)差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能進(jìn)行分類，見(jiàn)表2。

表2 差異表達(dá)基因

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了3個(gè)上調(diào)和3個(gè)下調(diào)表達(dá)基因，顯示基因芯片和實(shí)時(shí)熒光定量PCR兩種檢測(cè)技術(shù)對(duì)于檢測(cè)mRNA表達(dá)可信度均較好，變化方向一致。見(jiàn)圖1。

圖1 qPCR驗(yàn)證6個(gè)差異基因的表達(dá)

3 討 論

惡性腫瘤細(xì)胞具有遷移、侵襲和血管生成的生物學(xué)特性，這些生物學(xué)特性是腫瘤基因改變和環(huán)境異常共同作用的結(jié)果。本研究將結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞株進(jìn)行體內(nèi)連續(xù)傳代，獲得高轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌細(xì)胞株，并建立了高侵襲性結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型；同時(shí)利用cDNA-microarray技術(shù)篩選出結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移性相關(guān)基因，結(jié)果顯示，親代組與高轉(zhuǎn)移組之間有36個(gè)基因表達(dá)差異。

惡性腫瘤細(xì)胞高轉(zhuǎn)移生物學(xué)特性機(jī)制涉及腫瘤細(xì)胞由原發(fā)病灶脫落、轉(zhuǎn)移遷移、基底膜破壞、浸潤(rùn)、侵犯血管等過(guò)程〔3〕。本文結(jié)果顯示上調(diào)表達(dá)的基因中牽涉到粘連相關(guān)蛋白基因。MMP2和MMP9為MMPs(基質(zhì)金屬蛋白酶)家族成員，能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲生物學(xué)行為中發(fā)揮關(guān)鍵的作用〔4〕。我們篩選出的差異基因顯示高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌可能存在生長(zhǎng)因子信號(hào)通路異常高表達(dá)。以往研究表明酪氨酸激酶受體過(guò)度激活與腫瘤有良好的相關(guān)性。EPHB3是酪氨酸激酶受體Eph家族成員，可與ephrins結(jié)合相互作用參與腫瘤細(xì)胞遷移〔5〕。研究表明在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中高表達(dá)EPHB3能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，而干擾EPHB3表達(dá)可顯著抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移以及在體內(nèi)的成瘤和轉(zhuǎn)移能力〔5〕。本文結(jié)果顯示EPHB3高表達(dá)與結(jié)腸癌的高轉(zhuǎn)移性有關(guān)。高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組中PTPN11和PTP1B基因較低表達(dá)也從另一方面說(shuō)明了酪氨酸磷酸酶與腫瘤細(xì)胞高轉(zhuǎn)移生物特性相關(guān)〔6〕。PTPN11和PTP1B均為蛋白酪氨酸磷酸酶家族成員，能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞酪氨酸激酶磷酸化水平從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移、轉(zhuǎn)錄和凋亡等；并且還與細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)相關(guān)，該類酶活性的降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞表面抗原低表達(dá)，從而使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃脫。

細(xì)胞周期調(diào)控在高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌發(fā)生中可能發(fā)揮重要作用，而細(xì)胞周期的關(guān)鍵是G1期的啟動(dòng)。Cyclin D1(CCND1)是調(diào)控細(xì)胞周期的基因，在G1期合成，并與CDKs蛋白家族成員形成復(fù)合物從而參與細(xì)胞周期控制。近來(lái)也發(fā)現(xiàn)Cyclin D1蛋白在結(jié)腸癌中過(guò)度表達(dá)可能是該腫瘤進(jìn)展中的重要事件，還可能是獨(dú)立的預(yù)后因素〔7〕。細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控失衡共同作用可能是腫瘤細(xì)胞高轉(zhuǎn)移性的重要機(jī)制，但是其中確切的機(jī)制需要深入研究。

本文結(jié)果也表明細(xì)胞黏附分子異常表達(dá)可能參與高轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌發(fā)展，其中E-cadherin在高轉(zhuǎn)移性組中低表達(dá)。E-cadherin是細(xì)胞膜表面分子，介導(dǎo)上皮細(xì)胞-細(xì)胞間的黏附，這個(gè)結(jié)果似乎與之前其他的黏附分子表達(dá)不相一致，考慮到腫瘤細(xì)胞從原病灶脫落遷移至轉(zhuǎn)移部位再生長(zhǎng)后重新表達(dá)黏附分子，可能發(fā)揮了在原發(fā)病灶中不同生物學(xué)作用〔8〕。新近也發(fā)現(xiàn)CD82基因是腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，它的正常表達(dá)能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移能力〔9〕。在結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移組中CD82基因表達(dá)水平較親代組低，這樣可能更有利于結(jié)腸癌細(xì)胞高轉(zhuǎn)移生物學(xué)行為，其中機(jī)制需深入探討。

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