粒細胞集落刺激因子對腦出血大鼠的治療機制

何曉英 付 華 袁 平 譚 華 李小剛

(瀘州醫學院附屬醫院神經內科，四川 瀘州 646000)

粒細胞集落刺激因子(G-CSF) 是一種造血因子，最開始被用于治療粒細胞減少癥等血液系統疾病。研究證明G-CSF可通過血-腦脊液屏障在中樞神經系統發揮重要的非造血作用。目前越來越多研究發現G-CSF治療缺血性腦腦卒中有多種生物活性，可通過不同病理生理途徑產生神經保護作用。李健生等〔1〕報道G-CSF能通過動員骨髓干細胞改善腦卒中后神經功能受損癥狀；Sevimli等〔2〕、Sugiyama等〔3〕分別證實G-CSF在腦梗死模型中具有抗炎作用和抗凋亡作用；最近有研究表明，在腦缺血動物模型中G-CSF通過增強側支血管生長而改善腦血管的儲備能力〔4〕； Prasad 等〔5〕對急性期、England等〔6〕對亞急性期腦卒中的臨床試驗研究中也證明，G-CSF不僅能夠減少梗死面積，而且具有較高的安全性。本研究從腦水腫程度、基質金屬蛋白酶(MMP)-9動態表達以及星形膠質細胞活性變化角度，探討G-CSF對腦出血(ICH)大鼠的治療作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組 由瀘州醫學院動物實驗中心提供體重為250～320 g的SD大鼠96只，隨機分為假手術組(n=24)、ICH組和治療組(n=36)，其中各組又按6、24、48、72 h、7、10 d時間點分為6個亞組(假手術組n=4，ICH組、治療組n=6)。

1.2ICH模型的制作〔7〕SD大鼠術前禁食12 h，2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射后，俯臥位固定在立體定位儀上，無菌操作暴露前囟，用小型牙科鉆鉆透顱骨至硬腦膜處，定位于前囟前0.2 mm、中線右側旁開3 mm、深6 mm為注血點，將非肝素抗凝斷尾獲取的動脈血50 μl，先注入10 μl，停針2 min，后緩慢注入40 μl，注血時間約5 min，完畢后留針10～15 min，再緩慢退針。術后青霉素粉末涂抹局部，縫合皮膚。所用手術器械均經高壓滅菌消毒，整個手術過程無菌操作。假手術組：參照上述方法，經注入點注入等量無菌生理鹽水。治療組制模成功1 h后經腹腔注射重組G-CSF(60 μg/kg)，假手術組、ICH組經腹腔注射等量生理鹽水。

1.3腦組織含水率測定 各組大鼠于相應時間點(假手術組n=2，ICH組、治療組n=3)麻醉后迅速斷頭取腦，將取出的腦組織放在用生理鹽水浸潤過的濾紙上，以防止水分蒸發。去除軟腦膜和血跡，精密稱濕重。將取出的腦組織在100℃烤箱內烘烤24 h，再稱取干重。按Blliot公式計算腦組織含水率= (濕重-干重)/濕重×100%。

1.4MMP-9、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)表達測定 各組大鼠于相應時間點(假手術組n=2，ICH組、治療組n=3)麻醉后，經主動脈灌注4%多聚甲醛，取出腦組織，多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片。按照免疫組織化學試劑盒說明進行染色。采集系統對MMP-9、GFAP的表達測定采用陽性細胞計數法，每只大鼠選一張腦切片，在400倍光鏡下隨機選取血腫周圍的 4 個視野，計數每個視野的陽性細胞數，取平均值。MMP-9陽性表達為細胞膜及胞質呈棕褐色，GFAP陽性表達為細胞質及星狀突起纖維呈黃色或黃棕色。

2 結 果

2.1各實驗組大鼠腦組織含水率動態變化 ICH組腦組織含水率各時間點明顯高于假手術組(P<0.05)，6 h開始增高，24 h進一步升高，48～72 h達到最高峰。治療組各時間點腦組織含水率明顯低于ICH組(P<0.05)。見表1。

2.2各組大鼠血腫周圍組織MMP-9動態變化 ICH組各時點MMP-9表達明顯高于假手術組(P<0.05)，6 h少量散在表達，24 h開始增多，48～72 h達高峰，10 d仍有少量表達。治療組各時點MMP-9表達顯著低于ICH組(P<0.05)，6 h較少表達，同樣在24 h開始迅速增多，48～72 h達高峰，后逐漸下降。見表2。

2.3腦組織含水率與MMP-9相關性分析 假手術組腦組織含水率與MMP-9表達無相關性(r=0.429,P=0.396 1)；ICH組腦組織含水率與MMP-9表達呈正相關(r=0.922,P=0.008 9)；治療組腦組織含水率與MMP-9表達呈正相關(r=0.844，P=0.034 5)。

2.4各組大鼠血腫周圍組織GFAP測定 假手術組未見GFAP陽性細胞表達。ICH組6 h即有少量GFAP陽性細胞表達，分布稀疏、著色較淺、胞體體積較小、突起分支較少；48 h開始增多；72 h出現大量表達；7 d GFAP達高峰，胞體肥大、突起增粗且增長、著色較深，與組內其他時點比較差異顯著(P<0.05)；10 d GFAP陽性細胞表達減少。治療組6h GFAP陽性細胞表達與ICH組相似，24 h、48 h、72 h、7 d、10 d表達較ICH組明顯減少(P<0.05)，細胞變形程度減輕。見表3。

表1 各組不同時間點腦組織含水率比較

表2 各組不同時間點血腫周圍MMP-9表達(個/單位面積，

表3 各組不同時間點血腫周圍GFAP表達(個/單位面積，

3 討 論

動物實驗以及臨床實驗表明，在缺血性腦血管病中使用G-CSF干預的生存率及神經功能評分均高于對照組，這提示G-CSF在神經系統的損傷修復方面起著一定的生理作用，故在尨經保護領域受到越來越廣泛的關注。關于G-CSF在中樞神經系統發揮生物學作用的途徑，初期學者們推測可能是G-CSF動員了BMSC，促進前腦的神經干細胞分化并從側腦室向損傷區募集神經前體細胞來促進神經功能的重建。隨著研究的深入，Schabitz等〔8〕在離體實驗中發現在受到刺激的星形膠質細胞上有G-CSF表達，Schneider 等〔9〕發現體內正常腦組織神經元上也有 G-CSF表達，并且應用免疫組化、western Blot和RT-PCR法均證實鼠腦的神經元和膠質細胞有G-CSF受體(G-CSF-R)存在。在此基礎上，Hasselblatt等〔10〕試驗證實G-CSF在中樞神經系統通過與效應細胞表面特異性G-CSF-R結合發揮生物學作用。腦組織存在內源性G-CSF，腦損傷后機體啟動自我修復機制通過上述途徑使神經環路和功能得到部分重建。Solaroglu等〔11〕采用不能透過血腦屏障的碘化牛血清白蛋白作為對照，給大鼠注射碘化的G-CSF，計算注射后1 h，4 h，24 h 碘化G-CSF和碘化白蛋白的腦/血清比值，實驗發現G-CSF顯示一個較高的腦/血清比值，證實G-CSF能夠通過完整的血腦屏障，為外源性G-CSF治療中樞系統疾病提供了科學的基礎理論依據。

腦水腫是ICH最為嚴重的繼發性損傷，是導致腦組織結構改變和功能損傷的重要原因之一，有效減輕腦水腫是ICH的治療關鍵。本實驗建立大鼠自體血ICH模型，結果說明G-CSF減輕了ICH后的腦水腫。實驗進一步研究了G-CSF減輕腦水腫程度的可能機制。MMP-9是影響腦水腫發生發展的重要因素之一。Gursoy等〔12〕對基因遺傳工程小鼠的實驗研究證實MMP-9能夠改變血腦屏障通透性并加重腦水腫。應用核磁共振技術對臨床患者的觀察發現ICH患者腦水腫消長規律與血清MMP-9變化一致〔13〕。本實驗也說明ICH后MMP-9表達增強并參與了ICH后腦水腫形成。治療組各時點MMP-9表達明顯輕于ICH組，提示G-CSF抑制了MMP-9的表達，相關性分析發現治療組MMP-9表達和腦組織含水率也成正相關關系。因此，G-CSF可能通過下調MMP-9的表達減輕了ICH后腦水腫，其確切機制尚需進一步研究。

GFAP為僅存在于星形膠質細胞(Ast)中的單體中間絲蛋白，是細胞骨架的主要組成部分，通常情況下正常Ast的GFAP表達量不高，中樞神經損傷后GFAP 在Ast中有豐富而特異性的表達，是Ast活化的客觀標志蛋白〔14〕。中樞神經系統損傷時，Ast由常態轉化為反應性Ast，稱之為Ast活化，表現為Ast數量上增加，細胞胞體、胞核大小及突起長度的變化〔15〕。活化的Ast在腦損害后有利弊雙向作用：一方面，Ast活化，對細胞間隙的谷氨酸及H+、K+等清除能力增加可增強能量代謝能力；釋放神經營養因子增多，有助于受損神經元的修復；合成大量的載脂蛋白E重建神經元完整性，增加突觸聯系，促進神經修復及功能重建〔16〕。另一方面，活化的Ast可產生大量NO，通過對大分子特別是DNA的修飾，可導致細胞凋亡和壞死；可以產生多種細胞因子和炎癥介質介導炎性反應，促進內皮細胞壞死，引起血腦屏障開放，參與腦水腫病理過程；過度的膠質化也可以作為機械屏障妨礙髓鞘和軸索的再生，影響周圍神經組織結構和功能恢復〔17〕。 因此，活化的Ast對ICH后神經組織是一把雙刃劍，依靠神經系統代償性的自我調節不足以既發揮Ast的神經保護作用，同時又抑制Ast神經毒性作用，可能是導致ICH預后不佳的因素之一。因此，Ast在ICH中適度活化無疑具有重要意義。

本實驗觀察到假手術組無GFAP陽性細胞表達，表明Ast處于相對穩定狀態；ICH組6 h開始GFAP少許表達，隨時間延長逐漸增多，72 h大量表達，7 d達高峰，該規律與已有研究報道基本一致〔18〕；實驗結果提示G-CSF下調了ICH后GFAP表達，抑制Ast過度活化。理論上G-CSF抑制了ICH大鼠Ast過度膠質化，可增強對神經細胞的保護作用，而減輕對腦組織的損傷作用，但是怎樣才能使GFAP恰好維持在一個適當的水平從而最大程度發揮Ast的神經保護作用以及G-CSF抑制Ast過度活化的確切機制尚未明確，有待進一步研究。

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