脂聯素對高糖環境下胰島細胞功能及腺苷酸活化激酶和胰島素受體底物-1的影響

鄧 娟 孫 娟 李 偉

(徐州醫學院研究生學院，江蘇 徐州 221002)

胰島β細胞分泌缺陷和胰島素抵抗(IR)是糖尿病的重要病理生理基礎，目前β細胞功能缺陷的機制尚未完全闡明。脂聯素是新近發現的脂肪組織特異分泌的一個具有重要功能的細胞因子，具有調節糖脂代謝、改善IR、抗炎及抗動脈粥樣硬化等作用〔1，2〕，在延緩2型糖尿病及其慢性并發癥的發生發展中起了重要作用。然而，脂聯素對胰島細胞保護作用的具體機制尚不明確。本研究檢測脂聯素對胰島β細胞分泌功能的影響，探討脂聯素與IR的關系，并對其具體的分子信號機制進行初步研究。

1 材料和方法

1.1材料 INS-1細胞株購自上海拜力生物科技有限公司；胎牛血清，1640培養基 (美國Gibco公司)；重組大鼠球形APN(北京愛迪博)；大鼠胰島素測定ELISA試劑盒(北京愛迪博)；細胞裂解液、Western印跡用腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)蛋白兔抗大鼠單克隆抗體(購自美國Cell Signaling公司)；ECL顯色試劑盒(上海申能博采公司)；IRS-1酪氨酸磷酸化抗體(美國Santa Cruz)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 INS-1細胞株生長于含10%胎牛血清(FBS)的1640培養液中(含β- 巰基乙醇5 μl/L，青、鏈霉素各100 U/ml，加1 mmol/L丙酮酸鈉，10 mmol/L HEPES 粉，)，置于含5% CO2濃度的37 ℃恒溫培養箱中培育，至70%～80%融合后分為兩組：對照組：予5.5 mmol/L葡萄糖培養，加入100 μg/L脂聯素(從10～1 000 μg /L的劑量曲線中選出)；高糖組：予25.6 mmol/L葡萄糖培養，加入100 μg/L脂聯素。每3～4天用0.25%胰酶消化傳代，待細胞生長至亞融合狀態時，接種于96孔細胞培養板用于實驗。

1.2.2實驗分組 實驗分為對照組(5.5 mmol/L葡萄糖)，對照組+脂聯素組(5.5 mmol/L葡萄糖+100 μg/L脂聯素)，高糖組(25.6 mmol/L葡萄糖)，高糖+脂聯素組(25.6 mmol/L葡萄糖+100 μg/L脂聯素)，分別干預24 h，48 h，72 h。

1.2.3IR細胞模型的建立與分組 IR細胞模型建立參照文獻〔3，4〕。單層貼壁INS-1細胞用FFA(0.40 mmol/L)培養24 h后，于4 ℃條件下用預冷0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞3次，即成為具有IR的細胞模型。鑒定模型成功后，加入脂聯素。分成組三組：正常組、IR模型組、脂聯素組。

1.2.4模型鑒定 取培養液采用葡萄糖氧化酶法測定葡萄糖含量，裂解細胞提取蛋白質，用Braford微量法測定蛋白濃度。培養液中葡萄糖含量=樣品吸光度值/標準管吸光度值X標準品濃度(g/L)×1 L/g protein。細胞內糖原含量測定：蒽酮法測定細胞內糖原含量〔10-2×g/(g protein)〕，糖原含量=樣品吸光度值/標準吸光度值×標準品糖原含量(10-2×g)/g protein。

1.2.5酶聯免疫法(ELISA) 采用酶聯免疫試劑盒，按說明書操作，將各時間點收集得到細胞上清液在常溫下溶解，各取100 μl 分別加入已包被好胰島素抗體的ELISA 96孔板中。ELISA 間接夾心法檢測反應終止后，用酶聯免疫檢測儀測定450 nm處的A值，根據胰島素標準品A值曲線，換算所測上清液中胰島素的含量。

1.2.6Western印跡檢測AMPK蛋白的表達 ①收集細胞提取按照蛋白提取試劑盒(上海申能博采公司)的說明書操作；②Western印跡過程:依次灌制10% SDS-PAGE分離膠、5%聚合膠；轉膜；室溫下用TBS封閉液封閉1 h；于4 ℃將膜與一抗(AMPK 1∶1 000 )孵育過夜；TBS洗膜3次，每次30 min。將膜置于HRP 標記的二抗(1∶2 000)稀釋液中，室溫振蕩孵育1 h。洗膜液洗膜3次，每次30 min。暗室里按照ECL說明書加入發光液，室溫輕搖1 min，注意避光。在暗室中剪下與膜同樣大小的膠片，壓在暗盒中，約1～5 min；將膠片依次放在顯影液、定影液中洗；水沖洗，可在相應位置見到目的條帶β-actin為內參。Western印跡檢測IRS-1酪氨酸蛋白表達：①提取細胞蛋白質，BCA蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。取樣品蛋白質2 mg加IRS-1抗體過夜后加入蛋白A瓊脂孵育3 h。洗滌免疫沉淀復合物后加入Laemmli上樣緩沖液煮沸5 min，6%SDS-PAGE分離蛋白，電轉移法使蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，用含3%BSA的TBST溶液+含(0.05%Tween20)37 ℃封膜1 h后，分別加入用封閉液稀釋的IRS-1抗體磷酸酪氨酸抗體4過夜。洗膜后加入用辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖1 h，洗膜后用ECL顯像曝光，應用光密度掃描儀測各條帶密度。

2 結 果

2.1脂聯素對胰島分泌功能的影響 在5.5 mmol/L葡萄糖培養濃度下，脂聯素處理組的胰島素分泌水平在不同的孵育時間與對照組差異均無統計學意義(P>0.05)；與5.5 mmol/L葡萄糖培養濃度相比較，在25.6 mmol/L濃度下，兩組的胰島素分泌水平均顯著升高，其中脂聯素處理組的胰島素分泌在培養48～72 h后均高于高糖組(P<0.05)。見表1。

2.2培養液中葡萄糖含量及細胞內糖原含量變化 IR模型組培養液中葡萄糖含量明顯高于組，細胞內糖原含量顯著減少(P均<0.05)，加入脂聯素組中培養液中葡萄糖含量較IR模型組顯著降低，細胞內糖原含量升高(P均<0.01)。見表2。

2.3細胞中AMPK蛋白表達水平比較 與正常組比較，IR模型組AMPK蛋白水平明顯降低；而脂聯素可對抗高糖高脂的影響，使AMPK蛋白水平增加，見圖1。

表1 在不同葡萄糖濃度下脂聯素對胰島細胞胰島素分泌的影響

表2 各組培養液中葡萄糖含量及細胞內糖原含量

圖1 細胞中AMPK蛋白表達水平比較

2.4細胞中IRS-1酪磷酸化表達水平比較 與對照組比較，IR模型組IRS-1酪磷酸化水平明顯降低；而脂聯素可對抗高糖高脂的影響，使IRS-1酪磷酸化水平增加，見圖2。

圖2 細胞中IRS-酪磷酸化表達水平比較

3 討 論

脂聯素是脂肪細胞分泌的一種重要的脂肪因子。也被稱為AdipoQ、GBP28或Acrp30。它由244個氨基酸組成，相對分子質量為30×103。這一脂源性細胞因子可以顯著改善IR狀態，但其是否可以調節胰島β細胞的胰島素分泌功能，進而影響糖尿病的發生，目前尚存爭論。

脂聯素可以改善IR并在一定條件下促進胰島素的分泌。Gu等〔5〕發現，脂聯素處理后的胰島細胞在低糖(3.3 mmol/L)培養2 h內，其胰島素分泌被抑制；而在高糖(16.7 mmol/L)培養6～24 h，其胰島素分泌持續增加，提示指聯素在一定程度上是一種依賴于葡萄糖濃度的胰島素促泌劑。Okamoto等〔6〕發現C57BL/6小鼠注射APN后可促進胰島素分泌。王適龍等〔7〕研究發現脂聯素能促進高糖環境下的胰島素分泌，其機制可能與通過下調PPARγ，降低UCP-2的表達有關。有研究表明，葡萄糖刺激的胰島素分泌的本質是葡萄糖對AMPK的抑制〔8〕。脂聯素在外周的作用主要是通過AMPK介導〔9〕。脂聯素能夠激活骨骼肌細胞和肝細胞中的AMPK，刺激肝和肌肉中糖的利用和脂肪酸的β氧化，導致細胞內三磷酸腺苷(ATP)含量的增加。但脂聯素在胰島細胞內的作用方式至今尚無定論。業已證實，鼠β細胞中有1 型和2 型脂聯素受體的表達，并且在胰島素分泌性MIN6 細胞中也可檢測到這類受體的存在〔8〕。因此，da Silva Xavier等〔10〕提出假說，認為脂聯素在胰島細胞中也有與外周相似的作用途徑。

IR是臨床許多疾病如糖尿病、肥胖、高血壓與動脈硬化等疾病的共同的危險因素與病理生理基礎。IR的研究涉及許多方面，目前許多研究是關于胰島素受體和受體后信號傳導系統，尤其是胰島素信號鏈傳導障礙在IR中的作用日益引起人們的關注。

脂聯素是胰島素敏感性的一個重要的調控因子已有研究顯示，在糖尿病發生與發展過程中，血清脂聯素濃度的降低與體重增加、高胰島素血癥和IR呈平行關系〔11〕。有報道顯示2型糖尿病伴肥胖患者血清脂聯素濃度會下降，且血清脂聯素水平下降的程度與IR及高胰島素血癥具有一定的相關性〔12〕。

AMPK作為一種重要的蛋白激酶參與多種代謝過程，同時介導了細胞對營養和環境變化的適應，被稱為“能量感受器”。脂聯素具有促進糖脂代謝、減輕IR、抗炎以及抗動脈粥樣硬化等作用。Yamauchi等〔13〕在體內和體外實驗均發現，脂聯素刺激肌細胞中ACC 的磷酸化、脂肪酸的氧化、葡萄糖的攝取和乳酸鹽的生成都與AMPK的活化有關；當AMPK活性被抑制時，脂聯素產生的這些效應也均被抑制。這提示由脂聯素刺激的葡萄糖利用和脂肪酸氧化可能是通過AMPK的介導完成的。Kamon等〔14〕證實，在肌肉中脂聯素激活AMPK和過氧化物酶體增殖物活化受體γ，增加脂肪酸的β氧化，減少甘油三酯的含量，減輕肌肉中的IR；在肝臟，脂聯素同樣激活AMPK，下調葡萄糖-6-磷酸酶，減少肝臟葡萄糖的輸出。給IR大鼠模型注射一定劑量的AICAR ，可激活AMPK，通過胰島素信號通路提高機體的胰島素敏感度〔15〕。本實驗中可見脂聯素可顯著改善(FFA)誘導的IR細胞模型。另外，IR細胞模型組中AMPK表達減少，提示AMPK可能參與IR的形成。加入脂聯素組AMPK表達增加，推測脂聯素改善IR可能與提高AMPK蛋白的活性有關。

β細胞所表達的IRS家族主要包括IRS-1、IRS-2及IRS-3。IRS-1在整個胰島上廣泛分布。Yamauchi等〔13〕通過給嚴重IR的脂肪萎縮小鼠注射基因重組的脂聯素后發現，骨骼肌胰島素受體和Akt激酶磷酸化以及IRS-1酪氨酸磷酸化明顯增加。IRS主要通過PI-3K激活途徑發揮作用，是β細胞胰島素分泌的重要信號。動物實驗也證明，脂聯素基因敲除小鼠肌肉中PI-3K活性明顯降低，通過腺病毒載體轉染的方法提高血漿脂聯素水平后可顯著提高肌肉中PI-3K的活性，其胰島素敏感性明顯增加。本研究結果提示IRS-1酪氨酸磷酸化異常參與了IR的形成。加入脂聯素組IRS-1酪氨酸磷酸化表達明顯升高，提示脂聯素改善IR可能與提高IRS-1酪氨酸磷酸化表達有關，但具體的磷酸化位點有待進一步深入研究。

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