血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-D表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

張 偉 任鳳云 金 丹 潘艷明 胡 靜 馮玉寬

(牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江 牡丹江 157011)

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度決定了肺癌患者的預(yù)后和治療手段的選擇。近來(lái)，由于淋巴管的特異性標(biāo)志物如淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體(LYVE)-1,相關(guān)基因prox-1,足細(xì)胞表面蛋白podoplanin和單克隆抗體D2-40等的發(fā)現(xiàn)，使研究腫瘤新生淋巴管的臨床和病理學(xué)意義成為可能，也使腫瘤淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移逐漸成為研究熱點(diǎn)。目前普遍認(rèn)為，在一些腫瘤中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)-C和VEGF-D調(diào)控著淋巴管的生成，二者可以激活其受體VEGFR-3而誘導(dǎo)腫瘤淋巴管生成和促進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移。然而，已往多集中于VEGF-C的研究，并且這些研究表明非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)組織VEGF-C的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，抑制VEGF-C表達(dá)可明顯降低淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。而有關(guān)VEGF-D在NSCLC的表達(dá)及其臨床意義的報(bào)道較少。本文擬探討NSCLC組織VEGF-D的表達(dá)及微淋巴管密度(LMVD)與包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移在內(nèi)的病理學(xué)參數(shù)間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 選自2007年9月至2008 年6月哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院和附屬第三醫(yī)院確診為NSCLC患者的手術(shù)切除組織。其中腺癌58例，鱗狀細(xì)胞癌38例。樣本取自手術(shù)切除的肺葉組織，標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,4 μm 厚連續(xù)切片,常規(guī)蘇木素-伊紅(HE) 染色，其中60例新鮮組織置于液氮中速凍，儲(chǔ)存于-80℃低溫冰箱中直至RNA抽提。兔抗人VEGF-D多克隆抗體和鼠抗人D2-40單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司。PV-9000免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。實(shí)時(shí)定量(QRT)-PCR檢測(cè)試劑均購(gòu)自TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司。

1.2免疫組織化學(xué)染色和結(jié)果判定 免疫組織化學(xué)染色方法參照PV29000 兩步法免疫組織化學(xué)試劑盒,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,HE復(fù)染,中性樹(shù)脂封片,光鏡觀察。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作陰性對(duì)照。以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，參照以往研究的判定標(biāo)準(zhǔn),以每張切片中看到>30%的腫瘤細(xì)胞質(zhì)染色陽(yáng)性判定為VEGF-D陽(yáng)性。參照Weidner的判定標(biāo)準(zhǔn),在低倍鏡下，選取D2-40陽(yáng)性脈管最豐富的區(qū)域,然后在200 倍視野范圍計(jì)算5個(gè)視野的淋巴管數(shù)目,取其平均值作為L(zhǎng)MVD。

1.3RT-PCR

1.3.1總RNA 的提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 將肺癌組織從液氮中取出,研磨成粉末,轉(zhuǎn)入焦炭酸二乙酯(DEPC)水處理過(guò)的1.5 ml微量離心管(EP)管中,按比例加入總RNA 提取液RNAiso reagent (TaKaRa Code.D312,大連)，按說(shuō)明書(shū)提取肺癌組織總RNA ,-70℃保存待用。取適量稀釋后測(cè)定A260 和A280 時(shí)的吸光度比值,計(jì)算RNA 的濃度。另取5 μl RNA 溶液用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,觀察RNA 的完整性。取總RNA 1 μg ，以O(shè)ligo dT 和 Random 6 mers (TaKaRa,大連)為引物,使用PrimeScriptTM RT-PCR Kit (TaKaRa Code.DRR014A,大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng),按說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物-20℃保存待用。

1.3.2引物設(shè)計(jì)與合成 在GenBank上查找人VEGF-D基因的mRNA 序列,取其保守區(qū),使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，引物由TaKaRa寶生物工程(大連)有限公司合成。VEGF-D基因的引物序列為：正義5′-CCGTGAAAATGCTGAAAGAGG -3′，反義5′-GTTGCCGATGTGAATGAGGA-3′；GAPDH基因的引物序列為：正義5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反義5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。 隨機(jī)取兩樣本的cDNA作為模板,應(yīng)用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa,大連)進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，分析擴(kuò)增曲線和融解曲線，鑒定引物的特異性。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取樣品總RNA(500 ng)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以獲得的cDNA為模板，應(yīng)用Thermal Cycler DiceTM Real time system(TaKaRa,大連)進(jìn)行Real Time PCR擴(kuò)增，分析擴(kuò)增曲線的Ct值，取目的基因表達(dá)量豐富的樣品cDNA用EASY Dilution分別按8倍梯度稀釋(80、81、82、83、84倍)，以作為管家基因(GAPDH)和目的基因(VEGF-D)的標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，分別制作管家基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。RT反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptTM Buffer 2 μl,PrimeScriptTM RT Enzyme Mix 10.5 μl,Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl ，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl， Total RNA 2 μl ，RNase Free dH2O 4.5 μl，反應(yīng)條件為：37℃15 min 85℃5 s ；PCR反應(yīng)體系為：SYBR Premix Ex Taq(2×) 12.5 μl ,正義、反義引物(10 μmol/L) 0.5 μl 、RT產(chǎn)物2 μl、dH2O 10～25 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性10 s;95℃ 5 s ,60℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

1.3.4VEGF-D mRNA熒光定量PCR檢測(cè) 取各樣本cDNA 與相應(yīng)的引物按照以上條件混合,同上條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,將目的基因的CT值與標(biāo)準(zhǔn)曲線相比較計(jì)算目的基因的濃度。為消除RNA 降解的影響,以目的基因VEGF-D與內(nèi)參照(GAPDH) 的比值表示目的基因的相對(duì)含量。每個(gè)樣本重復(fù)3 次，以均值來(lái)表示結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1VEGF-D 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 免疫組化染色顯示VEGF-D主要表達(dá)于癌細(xì)胞的胞質(zhì)(圖1A),在癌侵犯邊緣的血管和淋巴管的內(nèi)皮也可見(jiàn)VEGF-D的陽(yáng)性表達(dá)(圖1B),并且在癌的基質(zhì)部分和成纖維細(xì)胞亦可見(jiàn)VEGF-D的陽(yáng)性表達(dá)(圖1C)。在96例NSCLC組織中,VEGF-D 在侵犯邊緣的陽(yáng)性率明顯高于癌中央組織的表達(dá),呈現(xiàn)染色不均一性(41.7% vs 24.0%,P=0.009)。

A B C

2.2VEGF-D 的表達(dá)與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 在癌侵犯邊緣區(qū)， VEGF-D高表達(dá)組的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及淋巴管侵犯的發(fā)生明顯高于低表達(dá)組(P=0.019,P=0.025)。然而在癌中央?yún)^(qū)卻未發(fā)現(xiàn)這種相關(guān)性。見(jiàn)表1。

2.3VEGF-D mRNA在NSCLC組織的表達(dá)與臨床病理資料的相關(guān)性 癌中心組織、癌侵犯邊緣組織和癌周?chē)谓M織表達(dá)量差異明顯。癌中央組織VEGF-D基因的表達(dá)量明顯低于癌周?chē)谓M織(0.193±0.154 vs 3.542±1.513,P<0.001)，VEGF-D mRNA的表達(dá)量在癌侵犯邊緣組織亦高于癌周肺組織 (4.309±2.075 vs 3.542±1.513,P=0.022)。

表1 NSCLC組織VEGF-D蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性〔n(%)〕

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中央部位的VEGF-D mRNA表達(dá)低于非淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，而在邊緣部位卻又截然相反。對(duì)于邊緣部位，VEGF-D mRNA的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或淋巴管侵犯具有相關(guān)性(P=0.007,P=0.033)。見(jiàn)表2。

2.4VEGF-D表達(dá)與LMVD的相關(guān)性 腫瘤組織中，癌邊緣部位LMVD明顯高于癌中央?yún)^(qū)(19.01±7.55 vs 15.15±5.72，P<0.001)，有淋巴管侵犯的腫瘤組癌邊緣LMVD明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(21.37±7.93 vs 17.48±6.27,P=0.009)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組癌邊緣LMVD明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(21.28±7.89 vs 17.81±6.90，P=0.024)。見(jiàn)圖2。

把LMVD高于平均密度的腫瘤組定義為高淋巴管密度組，反之定義為低淋巴管密度組。在癌侵犯邊緣區(qū),高淋巴管密度的VEGF-D mRNA表達(dá)明顯高于低淋巴管密度組(P=0.020)。而在癌中央?yún)^(qū)這種相關(guān)性未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.541)。

圖2 淋巴管的免疫組化染色及淋巴管密度與淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

表2 NSCLC組織VEGF-D mRNA表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性

3 討 論

腫瘤血管生成與腫瘤的血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但大部分惡性腫瘤特別是上皮來(lái)源的惡性腫瘤早期以淋巴道轉(zhuǎn)移為主，因此，區(qū)域引流淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況是評(píng)估預(yù)后和制定治療策略的重要生物學(xué)指標(biāo)。目前認(rèn)為除少數(shù)的惡性腫瘤(如肝癌、小細(xì)胞肺癌)之外，大多數(shù)腫瘤的淋巴道轉(zhuǎn)移早于血道轉(zhuǎn)移。

NSCLC在腫瘤早期即可發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，因此局部淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移程度是決定患者臨床病理分期和臨床治療的重要因素之一。前期關(guān)于NSCLC巴管生成的研究多局限于VEGF-C和其受體(VEGFR-3)的研究。然而，以往的這些研究在有關(guān)VEGF-C是否影響NSCLC預(yù)后這一問(wèn)題上始終未取得一致的結(jié)論〔1～5〕，因此VEGF-C表達(dá)與淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系仍然備受關(guān)注〔6,7〕。VEGF-D是VEGF家族中的另一成員，研究〔8〕顯示可以誘導(dǎo)鼠腫瘤模型淋巴管生成和促使腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管轉(zhuǎn)移。但是很少有文獻(xiàn)報(bào)道VEGF-D在NSCLC中的表達(dá)意義，因此在NSCLC中的VEGF-D表達(dá)與淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系人們知之甚少。

Arinaga〔3〕,Ogawa〔5〕和Renyi-Vamos〔1〕等應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色方法報(bào)道VEGF-C表達(dá)與NSCLC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生沒(méi)有明顯的相關(guān)性，而Kajita等〔2〕表達(dá)二者明顯相關(guān)。Niki〔4〕和Maekawa等〔9〕報(bào)道在肺腺癌VEGF-D的低表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生明顯的相關(guān)。許多學(xué)者〔10〕認(rèn)為，上述結(jié)論不一致性主要是由于研究方法不同或是腫瘤之間VEGF-D的表達(dá)不均一。提示VEGF-D的表達(dá)可能是調(diào)控淋巴管生成的重要因子。Yokoyama等〔11〕報(bào)道VEGF-D通過(guò)與其在淋巴管和血管表達(dá)的特異受體結(jié)合建立的旁分泌途徑，調(diào)控腫瘤的淋巴管和血管生成。本研究結(jié)果提示，免疫組化和PCR研究結(jié)果是否一致很可能取決于所檢測(cè)部位，雖然通過(guò)QRT-PCR檢測(cè)，顯示VEGF-D mRNA表達(dá)水平不僅僅來(lái)源于腫瘤細(xì)胞，還有間質(zhì)細(xì)胞等陽(yáng)性部位，但是癌侵犯邊緣VEGF-D mRNA同時(shí)高表達(dá)，而且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和淋巴管侵犯的相關(guān)性提示，VEGF-D的高表達(dá)有利于腫瘤淋巴管生成和腫瘤細(xì)胞經(jīng)淋巴管道轉(zhuǎn)移，同時(shí)提示對(duì)VEGF家族整體的研究也許比在實(shí)驗(yàn)條件下單獨(dú)研究其中某一因子更為重要。

有研究〔5〕顯示腫瘤侵犯邊緣的高LWVD有可能決定著腫瘤細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移。雖然有一些關(guān)于NSCLC淋巴管生成的臨床材料研究〔3,4，12〕，但還沒(méi)有有關(guān)腫瘤邊緣LMVD與VEGF-D mRNA表達(dá)的相關(guān)性研究。

綜上，在NSCLC組織中VEGF-D的表達(dá)可能調(diào)控著腫瘤的淋巴管生成，癌侵犯邊緣VEGF-D的高表達(dá)可能與淋巴管的生成和腫瘤細(xì)胞發(fā)生淋巴管侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究也說(shuō)明，VEGF-D 在NSCLC組織不同部位的表達(dá)有明顯的差異，對(duì)癌組織的不同部位選擇VEGF-D表達(dá)，會(huì)更加有利于評(píng)估患者的淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況。

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