SALL4在結直腸癌進展和轉移中的作用

馬從乾 王 雅 趙 星 楊 軻

(南陽市中心醫院血管外科，河南 南陽 473000)

雙樹樣基因(SALL)4在維持胚胎干細胞功能方面發揮重要作用，其激活或者抑制通過調節關鍵轉錄因子和遺傳調節器參與組織的自我更新和多功能化。在干細胞中，SALL4通過調節轉錄和基因的表達也可導致染色質重塑〔1〕。SALL4與重要細胞信號通路如Wnt和轉化生長因子(TGF-β)有直接的聯系，因此，SALL4與細胞凋亡和惡性腫瘤的發生有一定的關聯〔2，3〕。SALL4調節正常干細胞的分化，在腫瘤細胞和腫瘤干細胞中也有同樣的作用〔4〕。結直腸癌(CRC)的進展涉及各種信號轉導通路，但是關于SALL4在CRC中的分子流行病學及SALL4的表達與CRC的關系研究還很少。本研究將探討SALL4的表達及與CRC臨床病理特征之間的相關性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集南陽市中心醫院普外科2009年1月至2013年1月64例CRC患者的新鮮腫瘤組織和配對正常組織標本，患者在術前沒有接受化療或放療。所有標本都經病理學診斷證實為CRC。標本獲取均獲患者知情同意，并且臨床資料完整。

1.2主要儀器與試劑 RNAiso plus試劑，RT-PCR試劑盒、DNA Marker、反轉錄試劑和PCR試劑(大連寶生物工程公司)，高通量組織破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，超凈工作臺(珠江市再鑫儀器有限公司)，離心機(Thermo Scientific公司)，PCR儀(Agilent Technologies公司)。

1.3引物設計 按照GenBank提供的SALL4基因序列(NM 020436.3)，由上海生物工程公司設計合成兩對目的基因引物，正義′：ATCGAGAACACCATGGCTCTG，反義′：GACTGGGAGCCATCCATCTTG。管家基因GAPDH為成品(RT-PCR Primer HS002)，直接稀釋使用。

1.4RQ-PCR檢測目的基因 (1)RNA提取：稱量100 mg組織，加入1 ml RNA iso，然后加入滅菌消毒的鋼珠經高通量組織破碎儀破碎后劇烈振蕩，轉移至1.5 ml EP管，加氯仿200 μl顛倒混勻，靜置5 min，4℃12 000 r/min離心10 min，取上清后加等體積異丙醇，混勻，靜置15 min，4℃12 000 r/min離心15 min，棄上清，加1 ml 75%乙醇后室溫干燥，RNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，測吸光度(A)值，計算RNA含量。(2)逆轉錄反應：以提取的腫瘤組織、正常組織及不同梯度稀釋標準品的RNA為模板，逆轉錄體系(10 μl)：模板1 μl，隨機引物0.5 μl，5×Prime Script TM緩沖液2 μl，dNTP混合液0.5 μl，Prime Script TMRTEnzyme Mix 10.5 μl，RNA ase Freed H2O 5.5 μl。反轉錄反應條件37℃15 min，85℃ 5 s。(3)RQ-PCR：以逆轉錄合成的cDNA為模板，20 μl的PCR反應體系包括SYBR Premix ExTaqI 10 μl，目的基因與管家基因的定量引物各0.8 μl，dH2O 6.4 μl，將配好的PCR反應液每孔分裝18 μl，按順序加腫瘤組織、正常組織及不同梯度稀釋標準品的cDNA 2 μl，置于Light Cycler定量PCR擴增儀上，反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火/延伸20 s，40個循環，95℃10 s，65℃15 s。

1.5統計學方法 應用SPSS13.0軟件，分別應用χ2檢驗和連續校正t檢驗和單因素方差分析、直線回歸相關分析。

2 結 果

2.1腫瘤組織中SALL4基因的表達 SALL4在腫瘤組織中的表達高于正常組織(P<0.05)。

2.2SALL4基因表達與結直腸癌臨床病理特點的關系 SALL4基因高表達與不良預后相關，與淋巴結轉移相關(P<0.05)。19例淋巴結轉移患者中有15例過表達SALL4(均數為8.25±1.26)；無淋巴結轉移患者中，76%患者的SALL4表達(均數為4.68 ± 3.72)。SALL4和腫瘤細胞分化程度相關。高分化組29例(78.4%)、中分化組19例(86.4%)腫瘤組織過表達SALL4(P<0.05)。SALL4的表達與腫瘤分期相關，腫瘤浸潤深度等病理特點無關。相關分析顯示，SALL4過表達與性別相關(P=0.037，r=0.372)，男性SALL4表達高于女性(均數分別為6.25 ± 4.20和4.64 ± 3.54)；在腫瘤晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)，SALL4過表達與淋巴結轉移數目呈負相關(P= 0.021，r=-0.437)。見表1。

表1 SALL4的表達與臨床病理參數之間的相關性〔n(%)〕

3 討 論

SALL4作為胚胎干細胞的調控基因，在眾多惡性腫瘤都有表達，如乳腺癌和肺癌、B淋巴細胞淋巴瘤、骨髓異常增生綜合征(MDS)、急性髓系白血病(AML)、卵巢生殖細胞腫瘤(GCTs)、睪丸生殖系統細胞腫瘤〔2～11〕。SALL4在卵巢生殖細胞腫瘤進展中發揮重要的作用，特別是低分化階段，而且是生殖細胞源轉移性癌的重要特征性標志。此外，SALL4在乳腺癌和肺癌的診斷和治療中都有重要的作用〔5，6〕，并被認為是肝癌不良預后的一個分子，在肝癌的發生過程中起到一定的作用〔12〕。沉默腫瘤癌細胞株中SALL4基因，能夠抑制腫瘤的侵襲和轉移〔13〕。SALL4基因可被檢測，并且具有高敏感性和特異性，所以對于惡性腫瘤的診斷、評價預后和治療中有很大的價值。本研究表明SALL4高表達與CRC的淋巴結轉移和臨床分期相關，預示著SALL4高表達是CRC不良預后的一個指標。

在CRC樣本中，SALL4基因的高表達通過抑制凋亡前基因如磷酸酯酶與張力蛋白同源物(PTEN)抑制轉錄，從而促進腫瘤細胞的存在有基礎性作用。與其他正常組織相比，在CRC細胞中，PTEN基因表達下調或者缺失。PTEN基因表達的缺失來源于PTEN基因家族的各種突變〔14〕。SALL4基因的下調導致凋亡的發生，PTEN基因的激活可誘導凋亡的發生〔15〕；同時有研究〔16〕發現，在CRC中，PTEN基因有腫瘤抑制作用。在CRC腫瘤組織中，SALL4基因的高表達導致了PTEN基因的下調。因此，SALL4基因的高表達通過抑制腫瘤抑制基因PTEN的轉錄，進而抑制凋亡的發生而促進CRC細胞的存活，進而促進腫瘤的進展。

4 參考文獻

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