慢病毒介導shRNA沉默人纖維介素基因對心肌微血管內皮細胞增殖、遷移的影響

王 亮 吳友平 鄭振中 殷 然 王夢洪 鄭澤琪 彭景添 魏云鋒

(南昌大學第一附屬醫院心血管內科，江西 南昌 330006)

人纖維介素(fgl2)屬于纖維蛋白家族中的一員，是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，可分為胞質、跨膜和胞外結構域3部分。fgl2由活化的巨噬細胞、血管內皮細胞表達，國內外有關fgl2的研究主要集中在肝病方面的研究，提示其可能參與血管新生等病理生理過程，但目前缺乏關于fgl2對MMVECs增殖、遷移等血管形成的關鍵環節的直接證據〔1～3〕。本研究通過制作并包裝fgl2的RNA干擾慢病毒，轉染心肌微血管內皮細胞(MMVECs)，觀察fgl2沉默對MMVECs增殖、遷移的影響。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 HEK293T細胞購自中科院上海細胞所；制備編碼慢病毒顆粒的重組病毒質粒及輔助包裝原件載體質粒購自上海吉凱基因化學公司；Lipofectamine2000、Trizol試劑盒購自Invitrogen公司；逆轉錄RNA試劑盒購自Promega公司；RNase-free購自Axygen公司；小鼠抗人Flag抗體購自美國Sigma公司，山羊抗小鼠IgG 抗體、小鼠抗人GAPDH 抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2shRNA慢病毒重組載體構建及病毒包裝 從GenBank中查找大鼠fgl2基因，按RNA干擾序列設計原則，設計4組針對fgl2基因cds區的靶序列，同時按公認標準設計合成無意義序列作陰性對照(PSCNC)。每組序列均按發卡結構模式設計合成，在其兩端設計酶切位點黏端，直接聯入酶切后的載體。DNA片段均由上海吉凱基因公司合成。設計合成的寡核苷酸片段稀釋后在退火反應體系中形成雙鏈DNA片段，經T4 DNA連接酶插入到經AgeⅠ和EcoRⅠ雙酶切后的線性質粒pGCSIL-GFP中?；厥蛰d體片段，與雙鏈DNA片段行連接反應,轉化大腸桿菌感受態細胞DH5α，搖菌后接種到LB瓊脂培養基，篩選陽性克隆行PCR及測序鑒定。每組產物中隨機選5個菌落克隆溶于10 μl LB中，取1 μl為PCR模板；陰性對照為dd H2O；陽性對照為含針對GAPDH siRNA插入片段的載體質粒。fgl2上游：5′- CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA -3′；下游:5′- GTAATACGGTTATCCACGCG -3′。PCR反應條件：94℃預變性30 s；94℃變性30 s，55℃退火30 s,72℃延伸30 s，30個循環，72℃延伸6 min，4℃保存。

Western印跡檢測外源篩選有效靶點的干擾效果，確認有效靶點并進行病毒包裝。將含慢病毒包裝系統質粒的DNA溶液(pGC-LV載體20 μg，pHelper1.0載體15 μg，pHelper2.0載體10μg)，與Opti-MEM等體積混勻，調總體積為2.5 ml,與脂質體2000混勻，室溫孵育20 min,轉到含293T細胞的培養基中培養。收集轉染48 h后的細胞上清液，4℃，4 000 r/min離心10 min，過濾上清，離心，棄上清，加PBS 50～100 μl，-80℃保存。96孔板接種293T細胞，調至每孔4×104個細胞，培養過夜。根據待測滴度，每個Ep管加90 μl無血清培養基。取待測病毒原液10 μl至第1管中混勻，繼續相同的操作至最后1管。選所需的孔棄培養基，加等量稀釋的病毒液，培養4 d后觀察熒光表達情況，將最后兩個含熒光細胞的孔中熒光細胞的個數乘以稀釋倍數即病毒原液的滴度值。系列稀釋法測定病毒滴度為1×109TU/ml。

1.3MMVECs培養與鑒定 取7 d大鼠乳鼠心臟剪去主動脈、左右心房、右心室，保留左心室，用PBS洗凈血液。小心剝離心外膜及心內膜。用75%乙醇滅活30 s，用PBS沖洗干凈，剪碎，加入適量的0.08%胰蛋白酶，37℃水浴消化3次。適量0.1% Ⅱ型膠原酶(用不含血清DMEM稀釋)消化組織，置于孵箱中消化3 h。轉移至超凈臺中，加含血清的培養基終止消化。1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸沉淀。反復離心3次。離心所得的細胞用200目篩網過濾，過濾后所得細胞懸于20%胎牛血清DMEM培養基，接種于0.2%明膠預處理的培養瓶中37℃培養。每隔2 d換液1次，直至長成細胞單層，0.125%胰蛋白酶消化傳代，選第3代傳代內皮細胞。0.125%胰蛋白酶消化貼壁細胞，傳代至爬片上，孵箱過夜，待細胞貼壁長滿后，取出爬片，固定后采用免疫熒光方法檢測MMVECs特異性標志CD31-RA、Ⅷ-RA。

單純MMVECs組(對照組)、攜帶GFP空載質慢病毒轉染MMVECs(GFP組)、Fgl2shRNA慢病毒轉染MMVECs(fgl2-RNAi-LV組)。培養96 h后分別收集MMVECs。取第3代MMVECs用于轉染，轉染前1 d將MMVECs以適當密度接種于6孔細胞培養板內。24 h待細胞密度達60%～70%時即可用于轉染。轉染前2 h將細胞培養基更換為無血清培養基，慢病毒轉染6～8 h后，更換20%胎牛血清培養基。24～72 h后熒光顯微鏡下觀察GFP表達。

1.4細胞總RNA提取及鑒定 轉染96 h后，去除6孔板中的培養基，按1.0 ml/1.0×106細胞加入的Trizol試劑，輕輕晃動，使其充分裂解。移入1.5 ml去RNA酶的EP管中，室溫(15℃～30℃)靜置5 min。嚴格按照Trizol試劑說明書進行，加入0.2 ml氯仿，蓋緊蓋子劇烈震蕩EP管15 s，室溫靜置3 min。4℃，8 000 r/min，離心15 min，可見混合物分層。將上層水相約350 μl轉移入另一新的去RNA酶EP管中，加入0.5 ml異丙醇，混勻后室溫靜置10 min。4℃，8 000 r/min，離心10 min，管底可見白色的RNA沉淀。棄上清，加入75%乙醇1.0 ml，混勻后，4℃，5 000 r/min，離心5 min。棄上清，空氣中干燥RNA沉淀，加入20 ml DEPC水溶解。樣本RNA取少許稀釋100倍后，以核酸蛋白分析儀測定OD260、OD280及OD260/OD280值，計算RNA的純度和濃度，-70℃保存以備用。

1.5qRT-PCR測定各組MMVECs中fgl2 mRNA的表達 引物的設計根據 GenBank 庫中相應 cDNA 序列進行。每個樣品重復3次，用ABI7500檢測分析。以作β-actin內參，用2-△△Ct計算結果。引物序列及反應條件見表1。

表1 引物序列及反應條件

1.6MTT檢測內皮細胞增殖能力 用含10%胎牛血清得培養液配成單個細胞懸液,以每孔104個細接種細胞接種到 96 孔板,每孔體積 200 μl(每組設8個孔，2個對照孔)按照一般內皮細胞培養條件，培養4 d。培養4 d后,每孔加 MTT 溶液(5 mg/ml用 PBS 配制,pH=7.4)10 μl，繼續孵育 4 h,呈色，終止培養,小心吸棄孔內培養上清液，每孔加 100 μl DMSO,振蕩10 min，使結晶物充分融解，選擇 490 nm波長,在酶聯免疫監測儀上測定各孔光吸收值,記錄結果,以時間為比色橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.7Transwell檢測細胞遷移能力 將小室放入培養板中，在上室加入300 μl預溫的無血清培養基，室溫下靜置15～30 min，使基質膠再水化。再吸去剩余培養液。消化細胞，終止消化后離心棄去培養液，用PBS洗1～2遍，用含BSA的無血清培養基重懸。調整細胞密度至5×105，取細胞懸液200 μl加入Transwell小室。24孔板下室加入500 μl含20%FBS的培養基。將細胞放入細胞培養箱繼續培養12 h。細胞計數統計：用棉簽上室內的細胞，用0.1%結晶紫染色，在顯微鏡下，取5個視野計數細胞個數。

2 結 果

2.1qRT-PCR檢測fgl2shRNA慢病毒轉染MMVECs后fgl2的表達變化 與對照組(為參照)與GFP組比較，fgl2-RNAi-LV組的fgl2表達明顯下調(0.198±0.02，P<0.05)，而對照組與GFP組(0.984±0.08)無明顯差異，提示慢病毒轉染MMVECs后fgl2的表達明顯下降。

2.2Transwell檢測細胞遷移能力 與對照組(7.8±1.24)與GFP組(7.4±1.56)比較，fgl2-RNAi-LV組的遷移能力增強(16.2±2.44,P<0.05)，而對照組與GFP組無明顯差異(P>0.05)。見圖1。

2.3MTT檢測內皮細胞增殖能力 與對照組與FGP組比較，fgl2-RNAi-LV組的MMVECs的增殖能力與遷移能力增強(P<0.05)，而對照組與GFP組無明顯差異(P>0.05)。見圖2。

圖1 Transwell檢測各組細胞遷移能力(×400)

圖2 MTT檢測MMVECs增殖

3 討 論

慢病毒載體是近年來發展起來的一種新型載體,其感染效率高、細胞免疫反應小,而且能通過基因整合穩定持續地產生小干擾RNA(siRNA)而發揮沉默效應〔4〕。RNAi是一種能夠高效、特異地下調目標基因表達,并在基因功能學研究和基因治療領域有著廣闊應用前景的技術〔5～7〕。本研究合成的pGCSIL-fgl2shRNA 慢病毒表達載體具有高效的感染效率、確切的干涉效果及持續穩定的表達優勢，將fgl2-shRNA慢病毒轉染MMVECs,收集細胞,經實時定量PCR檢測，fgl2明顯下調,說明fgl2-shRNA載體構建成功。

在血管生成過程中,血管內皮細胞增殖和遷移是血管發生的最基本和最重要的環節〔8〕。MMVECs是缺血心肌血管新生的重要因素。大血管內皮與微血管內皮細胞在生物活性〔9〕，對各種物質反應性等方面均存在著明顯的不同〔10〕，并且微血管內皮細胞具有顯著的組織器官異質性〔11〕，即與細胞所來源的器官功能密切相關。利用大血管內皮細胞研究的結果很難客觀、準確地解釋微血管內皮細胞。所以要準確地反映所研究的組織

或器官的功能機制，最好選擇組織或器官的微血管內皮細胞作為研究對象〔12〕。本研究結果發現fgl2基因沉默能夠促進MMVECs的增殖和遷移，提示fgl2參與微血管內皮細胞血管新生的調控，但是其機制并不清楚。

總之，本研究明確了fgl2參與調控心肌微血管內皮細胞增殖、遷移等血管新生關鍵環節，為進一步研究fgl2在血管新生調控奠定基礎。

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