K-CoxB-JN復(fù)方提取物對(duì)小鼠急性阿霉素心肌損傷的保護(hù)作用

林 清 馬會(huì)霞 高秀娟 李 潔 姚榮妹 謝 飛 徐 靜 王 巍 包巨太

(河北聯(lián)合大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063000)

病毒性心肌炎(VMC)是一種心肌纖維及心肌細(xì)胞受到病毒侵害后出現(xiàn)的一系列變性、壞死疾病，發(fā)病率逐年上升。近年來(lái)運(yùn)用中藥治療VMC，取得了可喜的成果?？箍滤_奇病毒B病毒性心肌炎膠囊(K-CoxB-JN)是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下研制而成的中藥復(fù)方制劑，對(duì)于VMC的治療具有較好的療效〔1，2〕。本實(shí)驗(yàn)探討K-CoxB-JN復(fù)方提取物對(duì)心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性昆明小鼠，體質(zhì)量(20±2) g，北京華埠康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(京)2009-0004，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物處置符合國(guó)家科技部2006年9月頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》中動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2藥品與試劑 K-CoxB-JN復(fù)方藥材(西洋參、黃芪、五味子、丹皮、麥冬、萊菔子、王不留行)購(gòu)自石家莊市柏林藥材加工廠(批號(hào)20100225)；阿霉素(ADM)，購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：20040416；血清肌酸激酶(CK)，磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20100111；心肌肌鈣蛋白I(cTnI)測(cè)定試劑盒，購(gòu)自德國(guó)Bgaer公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；K-CoxB-JN復(fù)方提取物總黃酮、總多糖由課題組自制。

K-CoxB-JN復(fù)方總黃酮提取方法:采用乙醇回流提取的方法，首先稱(chēng)取藥材，置圓底燒瓶中，分別一次加入8倍量和6倍量濃度為80%的乙醇，然后加熱回流提取3 次，每次2 h，將最終3次提取的藥液合并，過(guò)濾，通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收乙醇，同時(shí)濃縮藥液。最后濃縮液分別用石油醚及乙酸乙酯等體積萃取3次，取上清液，合并濃縮提取液，剩余藥液70 ℃水浴蒸發(fā)成膏狀，之后在70 ℃鼓風(fēng)干燥機(jī)中干燥即得總黃酮。K-CoxB-JN復(fù)方多糖提取方法: 采用乙醇回流提取的方法，首先稱(chēng)取藥材，置圓底燒瓶中，加入8倍量95%乙醇，加熱回流提取1.5 h后，將藥材分別加入8、6、6 倍量水煎煮3 次，每次1.5 h，再合并提取液，過(guò)濾、濃縮，將濾液調(diào)至含醇量60%，過(guò)濾藥液，將沉淀干燥至恒重即得粗多糖。

1.3實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平，購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司；電子調(diào)溫電熱套購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司，型號(hào)：98-1-B；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自上海亞榮生化儀器廠，型號(hào)：RE-5205；全自動(dòng)生化分析儀，購(gòu)自北京朗普信科技有限公司；低溫離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)TDL-5-A； 電熱鼓風(fēng)干燥箱，購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠，型號(hào)：GZX-9070 MBE；Bio-Rad3550型自動(dòng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；BX30 型 Olympus光學(xué)顯微鏡，購(gòu)自日本Nikon公司。

1.4方法

1.4.1分組及給藥 健康昆明雄性小鼠90只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、K-CoxB-JN總黃酮低劑量組(HL)、中劑量組(HM)、高劑量組(HH)、K-CoxB-JN總黃銅及多糖組(H+D)，每組15只。正常對(duì)照組用生理鹽水(NS)灌胃，0.2 ml/10 g，1次/d，連續(xù)7 d，第7天灌胃2 h后，腹腔注射0.9%鹽水20 mg/kg；模型組，0.9%鹽水灌胃同正常對(duì)照組，第7天灌胃2 h后，腹腔注射ADM 20 mg/kg；HL組、HM組、HH組給藥劑量分別為0.2、0.4、0.8 g/kg，0.2 ml/10 g灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d，第7天灌胃2 h后，腹腔注射ADM 20mg/kg，建立急性心肌損傷模型。H+D組，給藥劑量0.4 g/kg，給藥方式及構(gòu)建模型同HL組。

1.4.2心脾指數(shù)測(cè)定 小鼠心臟、脾臟稱(chēng)重，脾指數(shù)=脾臟質(zhì)量(mg)/體重(g)；心臟指數(shù)=心臟質(zhì)量(mg)/體重(g)。

1.4.3血清心肌酶及cTnI測(cè)定 小鼠急性心肌損傷模型建立24 h后，摘取小鼠眼球取血，用酶標(biāo)儀測(cè)定CK 和CK-MB吸光度值，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。按試劑盒說(shuō)明分別測(cè)定心肌組織MDA含量及SOD活性。

2 結(jié) 果

2.1心脾指數(shù)測(cè)定結(jié)果 K-CoxB-JN黃酮中、高劑量及黃酮+多糖組心臟指數(shù)與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，K-CoxB-JN黃酮中劑量組及黃酮+多糖組的小鼠脾臟指數(shù)與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠心臟指數(shù)和脾臟指數(shù)比較

2.2血清CK、CK-MB、cTnI測(cè)定結(jié)果 K-CoxB-JN黃酮低、中、高及黃酮+多糖組均能降低CK和cTnI的值，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，K-CoxB-JN黃酮低劑量組及黃酮+多糖組降低CK-MB的值，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠血清CK、CK-MB、cTnI水平比較

2.3心肌組織MDA含量及SOD活性測(cè)定結(jié)果 K-CoxB-JN黃酮中、高及黃酮+多糖組均能降低SOD的值，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，K-CoxB-JN黃酮中劑量組及黃酮+多糖組降低MDA的值，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠心肌SOD、MDA水平比較

3 討 論

VMC是心血管科常見(jiàn)疾病之一，發(fā)病趨勢(shì)逐年增長(zhǎng)，與擴(kuò)張型心肌病有一定聯(lián)系〔3〕。因此，早期診斷和治療VMC具有十分重要的意義。K-CoxB-JN由西洋參、麥冬、丹皮、五味子、黃芪等中藥組成，西洋參莖葉皂苷對(duì)心臟具有保護(hù)作用，馬寶蘭等〔4〕研究發(fā)現(xiàn)西洋參莖葉總皂苷可降低CK的活性，西洋參二醇組皂苷(PDQS)注射液對(duì)缺血再灌注損傷的心肌具有保護(hù)作用，而且PDQS能加強(qiáng)SOD，其活性高于對(duì)照組。黃芪具有抗病毒、改善微循環(huán)、促進(jìn)心肌供氧、降低心肌耗氧量、調(diào)節(jié)免疫等作用，對(duì)心血管具有一定的保護(hù)作用等〔5〕。周曉春等〔6〕發(fā)現(xiàn)生黃合劑能明顯提高VMC小鼠血清中SOD活性、降低MDA含量，對(duì)CVB3感染鼠也有一定治療作用。

臨床上衡量心肌細(xì)胞的損害程度一般選用心肌酶檢查，其對(duì)診斷心肌損傷有一定輔助作用。VMC患者中，心肌損害通常伴隨心肌酶學(xué)的改變，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生壞死、破裂時(shí)，心肌酶就會(huì)釋放入血液當(dāng)中，導(dǎo)致血清心肌酶水平升高。目前國(guó)內(nèi)最常用來(lái)監(jiān)測(cè)的心肌酶有AST、CK、LDH、CK-MB、HBDH等〔7〕。本實(shí)驗(yàn)主要檢測(cè)CK和CK-MB。CK是人體能量代謝過(guò)程中重要的酶類(lèi)，存在于動(dòng)物的心臟、腦以及肌肉等組織。VMC時(shí)，CK比其他酶出現(xiàn)早并迅速升至高峰，是應(yīng)用最廣泛的心肌損傷指標(biāo)。磷酸肌酸激酶(CK)3個(gè)同工酶中的CK-MB多存在于心肌，反映心肌損傷的情況，對(duì)心肌損害的早期診斷具有重要價(jià)值。cTnI僅在心肌細(xì)胞中表達(dá)，在人體骨骼肌細(xì)胞中不表達(dá)。在心肌中cTnI的含量是CK-MB的13倍，檢測(cè)外周血cTnI含量可反映心肌細(xì)胞的損傷程度〔8〕。由于cTnI變化在VMC中具有較高的特異性和靈敏性，目前已確定cTnI對(duì)VMC心肌損傷的診斷價(jià)值。MDA能夠直接反映體內(nèi)自由基損害，是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物。當(dāng)心肌細(xì)胞被病毒侵襲后，心肌細(xì)胞膜會(huì)引發(fā)一系列的氧化反應(yīng)，使細(xì)胞膜破壞，導(dǎo)致心肌組織氧自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化損傷。而SOD是可以清除自由基的一種酶，過(guò)多的自由基可使SOD損耗增加。

降低MDA的含量和提高SOD的活性、清除氧自由基，可加速VMC的康復(fù)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，K-CoxB-JN總黃酮低、中、高三個(gè)治療組及總黃酮+多糖組均能降低CK、 CK-MB和cTnI的值，并對(duì)SOD及MDA具有改善作用，說(shuō)明K-CoxB-JN總黃酮及皂苷可以降低心肌酶水平，對(duì)心肌具有保護(hù)作用。

4 參考文獻(xiàn)

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4馬寶蘭，秦緒花，史載祥，等. 西洋參臨床藥理研究進(jìn)展〔J〕.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011；23(5)：88-92.

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8余新超，鄭芙林，汪思應(yīng)，等.急性病毒性心肌炎血清肌鈣蛋白Ⅰ的表達(dá)及臨床意義〔J〕.中國(guó)基層醫(yī)藥雜志，2002；9(12):1067-8.