CXC趨化因子配體5對前列腺癌細胞生長的作用

齊亞靈 王偉群 張建華 趙曉蓮 張 坤 于海波 賈秀月 齊淑芳 邵明亮

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

前列腺癌發病率具有明顯的地理和種族差異。在歐美國家，前列腺癌的發病率最高，并且其病死率也僅次于肺癌，位于第二位。我國前列腺癌發病率每年以10%的速度快速增加。腫瘤的分子病理學機制錯綜復雜，多種生物分子都參與其發生與演進過程，目前眾多的研究已經證實趨化因子及其受體在腫瘤的眾多生物學中扮演著重要角色〔1〕。趨化因子是一類能使細胞發生趨化作用的細胞因子，其可通過趨化因子受體廣泛參與細胞的生長、發育、分化、凋亡等多種生理功能，并在多種病理過程中如腫瘤的生長、存活、遷移、血管發生、白細胞浸潤等發揮重要作用。本研究探討CXC趨化因子配體(CXCL)5受體(CXCR2)在前列腺癌細胞的表達及CXCL5對前列腺癌細胞生長的作用。

1 材料與方法

1.1實驗用細胞、試劑及儀器 PC-3、DU145及LNCaP細胞(美國ATCC)；RPMI1640 培養基、優質胎牛血清及胰蛋白酶(美國Gibco公司)； RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術研究所公司)；重組人CXCL5(美國PeproTech公司)；鼠抗人β-actin抗體、兔抗人CXCR2抗體(美國Santa Cruz公司)；青、鏈霉素、山羊抗小鼠IgG-HRP、山羊抗兔IgG-HRP、ECL顯影液(武漢博士德生物工程有限公司)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(美國Millipore公司)；EPS100 、EPS300電泳儀、垂直電泳槽、轉膜儀(上海天能科技有限公司)；全自動酶標儀(美國Biotek公司)。

1.2Western印跡檢測CXCL5 受體CXCR2在前列腺癌細胞中的表達 PC-3、DU145及LNCaP前列腺癌細胞接種于RPMI1640 培養基中(血清含量及雙抗濃度分別為10%和100 U/ml )，并培養于CO2濃度為5%的37℃培養箱中。待細胞融合度達到80%以上后，收集細胞，RIPA裂解液裂解細胞，BCA方法測定各細胞株蛋白濃度。將30 μg總蛋白于12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳后，轉移至PVDF膜(270 mA 1 h)；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h； PBST洗膜5 min×3次；鼠抗人β-actin(1∶500)抗體或兔抗人CXCR2抗體(1∶200)4℃孵育過夜；PBST洗膜10 min×3次；山羊抗小鼠IgG-HRP(1∶4 000)或山羊抗兔IgG-HRP(1∶4 000)37℃孵育45 min；PBST洗膜15 min×3次；ECL顯影液孵育膜2～3 min后置于暗盒中曝光，調整曝光時間并進行顯影和定影。實驗重復3次，以PC-3細胞β-actin條帶的灰度值為1，計算各條帶灰度值。各細胞株CXCR2與其內參actin灰度值之比代表各細胞株CXCR2蛋白的相對含量。

1.3MTT法檢測重組人CXCL5對LNCaP細胞生長作用的影響 重組人CXCL5用0.1%BSA溶解并稀釋至適當濃度，凍存于-80℃冰箱中備用。將對數生長的LNCaP細胞用RPMI1640培養基(血清含量及雙抗濃度分別為5%和100 U/ml)接種于96孔板中，1.5×103個/孔。次日，將96孔板中的細胞分為4組(對照組與實驗組)，每組6孔。對照組用上述培養基+0.1%BSA培養(CXCL5終濃度為0 ng/ml)；實驗組用上述培養基+CXCL5培養(實驗組CXCL5終濃度分別為5，10，20 ng/ml)。從加入CXCL5后培養至第3天，各組細胞換各自的培養基繼續培養，至第6天用MTT法檢測細胞增殖情況。

1.4統計學分析 使用SPSS19.0統計學軟件進行q檢驗。

2 結 果

2.1CXCR2蛋白在前列腺癌細胞中的表達情況 CXCR2在DU145和LNCaP細胞中表達量較高，而在PC-3細胞中其表達量則較低，PC-3、DU145和LNCaP細胞目的基因蛋白CXCR2與內參actin灰度值之比分別為0.36±0.056，1.44±0.107，1.65±0.089(P<0.05)(圖1)。

圖1 CXCR2蛋白在前列腺癌細胞的表達

2.2重組人CXCL5促進LNCaP細胞的生長 對照組及5、10、20 ng/ml組細胞的吸光度值分別為0.52±0.14，0.55±0.06，0.61±0.08和0.73±0.10。與對照組比較，20 ng/ml組增長率明顯增高(P<0.05)，這說明CXCL5可以明顯促進前列腺癌細胞LNCaP的增殖。

3 討 論

趨化因子是一類可介導細胞遷移、細胞激活、細胞分化和血管發生等多種功能的小分子物質。按多肽鏈一級結構不同，趨化因子可分為CXC、CC、C和CX3C等四個亞家族(C為半胱氨酸，X為任意氨基酸)。其中，靠近N端兩個半胱氨酸(Cys)之間插有任意一個氨基酸的被稱為CXC亞家族，同理，插有任意3個氨基酸的被稱為CX3C亞家族。目前CXC家族已發現16個成員，按其結構功能區第一個半胱氨酸前是否存在ELR結構(谷氨酸-亮氨酸-精氨酸，Glu-Leu-Arg)，進一步將其分為ELR+CXC和ELR-CXC兩類。目前認為ELR+CXC 類趨化因子(如CXCL1、CXCL3和CXCL5等)可以通過表達于癌上皮細胞上的CXCR2受體而促進其增殖、轉移和侵襲，并介導血管發生〔2～4〕。而ELR-CXC 趨化因子如CXCL4、CXCL9和CXCL10則可抑制內皮細胞的趨向性，從而抑制血管發生。有報道〔5〕表明，胰腺癌中CXCL5可通過激活Akt、ERK和STAT等信號通路而介導血管發生，并且CXCL5過表達與胰腺癌的低分化、高分期以及短期存活率密切相關。這與之前研究〔6〕的CXCL5在前列腺癌組織的表達率明顯高于前列腺增生組織的結果相一致。本實驗結果可見，與其他惡性腫瘤的研究結果相似，外源性重組CXCL5可促進前列腺癌細胞LNCaP的生長。之所以選擇LNCaP做生長實驗，這是因為相對于其他兩株前列腺癌細胞(PC-3和DU145)，CXCR2在LNCaP細胞株的表達量相對較多，因此，外源性CXCL5對其作用可能會更加明顯。實驗結果也印證了先前提出的假設，即癌間質表達的CXCL5以及癌上表達的CXCL5可分別通過旁分泌和自分泌作用于癌上皮的CXCR2受體而參與前列腺癌的發展與演進過程〔6〕；為進一步建立過表達CXCL5的前列腺間質細胞和癌上皮細胞細胞株，開展CXCL5旁分泌和自分泌機制研究奠定了堅實基礎。

4 參考文獻

1Balkwill F.Cancer and the chemokine network〔J〕.Nat Rev Cancer,2004; 4(7):540-50.

2Kakinuma T,Hwang ST.Chemokines,chemokine receptors,and cancer metastasis〔J〕 .J Leukoc Biol,2006;79(4):639-51.

3Ben-Baruch A.The multifaceted roles of chemokines in malignancy〔J〕.Cancer Metastasis Rev,2006;25(3):357-71.

4Okabe H,Beppu T,Ueda M,etal.Identification of CXCL5/ENA-78 as a factor involved in the interaction between cholangiocarcinoma cells and cancer-associated fibroblasts〔J〕.Int J Cancer,2012;131(10):2234-41.

5Li A,King J,Moro A,etal.Overexpression of CXCL5 is associated with poor survival in patients with pancreatic cancer〔J〕.Am J Pathol,2011; 178(3):1340-9.

6王偉群,孟德欣,齊亞靈,等.趨化因子CXCL5在前列腺癌組織表達的研究〔J〕.生殖與避孕,2012; 32(7):449-51.