耐力訓練對糖尿病糖脂代謝相關因子基因表達的影響

邵 月

(河南財經政法大學體育部，河南 鄭州 450002)

現代醫學研究認為，糖尿病(DM)是由于糖脂代謝紊亂誘發的“糖脂病”〔1〕。運動不但能夠提高胰島素敏感性，還可以通過獨立于胰島素之外的途徑促進骨骼肌葡萄糖轉運和利用，對2型糖尿病(T2DM)的預防和治療具有一定的現實意義，如何有效促進骨骼肌攝取和利用血糖也成為治療T2DM的一個新的研究方向。長期有規律運動對機體功能會產生良好的刺激和塑造作用。本研究選取代謝相關基因GLUT4、AMPKα2、PDK4和CPT-1β作為研究對象，在骨骼肌代謝酶基因轉錄水平上揭示病理條件下骨骼肌對長期耐力訓練產生運動適應的分子機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 2型糖尿病(T2DM)大鼠12只，約8周齡，體重(250±5)g，上海斯萊克實驗動物公司提供。自由飲食，環境溫度20℃～23℃，相對濕度50%～70%，自然光照。

1.2主要試劑與儀器 總RNA提取試劑Trizol購自Invitrogen；cDNA第一鏈合成試劑購自Promega；SYBR green PCR Master Mix購自TO YOBO(上海東洋紡)。Real-time PCR儀：Applied Biosystem StepOne型；離心機：Eppendorf 5804/R型。

1.3動物分組及運動方案 大鼠適應性喂養1 w后隨機分為安靜組(GKC)、耐力訓練組(GKE)。跑臺訓練6 w，速度≤16.7 m/min，訓練時段18∶30～22∶00，周日停訓1次。

1.4取材 末次訓練后24～48 h內大鼠斷頸處死，20 min內分別取完整的左右下肢腓腸肌，切分若干份后置于液氮中速凍，-80℃超低溫冰箱保存，待檢測。

1.5熒光定量PCR檢測GLUT4、AMPKα2、PDK4和CPT-1β的基因轉錄

1.5.1骨骼肌RNA的提取和鑒定 取腓腸肌樣品約100 mg進行RNA抽提，選取質量和純度符合RT-PCR要求的RNA進行逆轉錄反應。

1.5.2逆轉錄反應 取9.5 μl總RNA以oligo dT為引物進行反轉錄和cDNA合成。反應條件:37℃，50 min；70℃，10 min；冰上放置5 min，分成若干份-20℃儲存，備用。

1.5.3擴增引物 見表1。

1.5.4熒光定量PCR cDNA樣品按以下反應體系進行:2×SYBR green PCR MasterMix 10 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，ddH 204 μl，模板cDNA 4 μl，總體積20 μl。反應結束后，PCR儀給出各反應孔的Ct值，以β-actin基因為內參，根據公式2-ΔCt計算各樣品目的基因的相對表達量。

表1 用于實時熒光定量PCR的引物序列

2 結 果

如表2所示，GK大鼠耐力組AMPKα2 mRNA轉錄顯著高于GK安靜組(P<0.01)，但GLUT4 mRNA轉錄沒有顯著性差異(P>0.05)，PDK4 mRNA表達顯著性降低(P<0.05)，CPT-1β mRNA轉錄沒有顯著性差異(P>0.05)。

表2 耐力訓練對GK大鼠骨骼肌AMPKα2、GLUT4、PDK4和CPT-1β基因轉錄的影響

3 討 論

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是一種重要的代謝應激敏感性蛋白激酶，不僅參與糖、脂肪和蛋白質的代謝調節，還對基因轉錄和翻譯調控的因子以及多種信號轉導通路中的分子產生影響〔2〕。AMPKα2是AMPK最為重要的催化亞基，對于骨骼肌葡萄糖攝取具有重要意義，AMPKα2缺陷會增加罹患胰島素抵抗(IR)和T2DM的風險〔3〕。吳毅等〔4〕研究發現，T2DM大鼠骨骼肌AMPK的表達和磷酸化受損，本研究說明T2DM大鼠骨骼肌AMPKα2 mRNA轉錄對耐力訓練非常敏感，耐力訓練能夠逆轉已經受損的AMPK基因表達，應該是一種較好的運動適應，對改善DM進程有益。

葡萄糖跨膜轉運是主要限速步驟〔5〕，GLUT4是骨骼肌最重要的葡萄糖轉運體〔6〕。運動可直接影響GLUT4的基因表達，對于葡萄糖代謝失常和T2DM患者，可以改善身體血糖控制能力〔7〕，有規律運動似乎是最佳的天然基因療法。王丹等〔8〕發現，12 w游泳訓練可以使T2DM大鼠股四頭肌GLUT4 mRNA表達增加。結合AMPKα2水平來看，耐力運動可能極大增加了AMPKα2水平，繼而傳遞信號給GLUT4，使其隨之大量增加，并促使更多的GLUT4移向細胞膜表面來轉運葡萄糖。由此可見耐力運動對于葡萄糖轉運能力具有很大的改善作用，是一種非常好的運動適應。

丙酮酸脫氫酶復合體(PDC)緊密聯系糖酵解和氧化磷酸化過程，對有氧代謝過程至關重要〔9〕。PDK通過磷酸化過程滅活丙酮酸脫氫酶，IR或T2DM患者骨骼肌PDK4蛋白表達增加〔10〕。胰島素能通過磷酸肌醇3激酶通路抑制PDK4表達，DM患者糖皮質激素分泌增加，啟動并激活PDK4基因表達〔11〕。在T2DM動物的胰腺β細胞PDC活性顯著降低。高血糖、高血脂上調PDK mRNA降低了PDH活性〔12〕。PPAR-α是脂質儲存和分解代謝的重要調節因子〔13〕，PDK4是PPAR-α的主要靶點。高脂環境下，游離脂肪酸可激活PPAR-α，增加PDK的表達滅活PDC，減少乙酰輔酶A的生成，從而影響葡萄糖代謝過程。腫瘤細胞丙酮酸進入線粒體三羧酸循環通路障礙，產生“瓦氏效應”現象，其與線粒體PDK活性較高有關〔14〕。本研究發現耐力訓練使DM大鼠PDK4 mRNA顯著下降，這是DM大鼠對耐力訓練產生的一種良好的運動適應。PDK mRNA水平下降減弱了PDK對PDC的抑制，促進了乙酰輔酶A的生成，對葡萄糖的完全氧化供能有利，是運動改善DM癥狀的一種分子水平上的依據。

脂質調節因子CPT-1在運動改善血脂中發揮著積極作用。張明等〔15〕研究發現8 w有氧運動后高脂飲食小鼠骨骼肌PPARα及CPT-1mRNA表達有所提高。張玥等〔16〕研究也證實，運動能提高肝臟中PPARα、CPT-1表達量促進脂肪酸的利用。本實驗結果說明此時耐力訓練促進長鏈脂肪酸進入線粒體氧化的能力有限，可能DM大鼠并沒有啟用最經濟、最能源節省化的供能方式，仍然以葡萄糖氧化為主供能。實際上，本實驗在進行耐力訓練時還是有一定運動強度的，不可能完全依賴脂肪酸氧化供能，糖原供能仍然存在。但耐力訓練比較復雜，諸多客觀因素都會影響機體代謝狀態，所以本實驗現象仍然需要進一步研究。

綜上，6 w耐力運動干預可能通過能量敏感性通路AMPK-GLUT4葡萄糖轉運機制極大地促進骨骼肌糖攝取能力，對改善DM大鼠高血糖癥狀有利。耐力訓練能在一定程度上逆轉T2DM大鼠骨骼肌AMPK磷酸化受損狀況，可能對改善T2DM疾病進程有一定益處。PDK4水平下降減弱了PDK對PDC的抑制，促進了乙酰輔酶A生成，對葡萄糖的完全氧化供能有利，是運動改善DM癥狀的又一分子水平上的依據。耐力訓練對CPT-1β水平并沒有產生顯著性影響，說明此時DM大鼠可能仍以葡萄糖氧化為主供能。

4 參考文獻

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