2型糖尿病發病過程中microRNA27b、130的表達水平及調節

楊崇哲 劉 豐 銀孟卓 潘朝慶 張韶岡

(廣州市第一人民醫院老年病科，廣東 廣州 510180)

microRNAs參與細胞凋亡、增殖及分化、個體分化、脂肪代謝、激素分泌等細胞周期及生理過程，其獨特的生理功能使其與各種疾病關系的研究成為研究熱點〔1～4〕。隨著人們生活水平的不斷提高，我國糖尿病(DM)尤其是2型糖尿病(T2DM)的發病率呈顯著升高趨勢。但DM的發病機制尚未完全闡明，在預防和治療方面也仍不完善〔5，6〕。T2DM是一種多病因的代謝性疾病，與基因異常等多種因素相關。而目前對其大量研究工作僅集中于T2DM編碼蛋白的易感基因篩查和功能的鑒定，關于microRNA異常與其發病的關系知之甚少。過氧化物酶體增殖物激活受體gamma(PPARγ)作為治療DM重要藥物的靶點，是在DM分子機制中起重要作用的核受體和轉錄因子。本實驗首次應用實驗DM大鼠進行microRNA、PPARγ及其于DM相關性檢測，以探討microRNA在T2DM發病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1試劑及設備 鏈脲佐菌素(STZ，美國sigma公司)；one touchⅡ血糖儀(美國強生公司)；DNA DNase I(fermentas公司)；Taqman microRNA試劑盒 (ABI公司)；LightShiftTM Chemiluminescent EMSA試劑盒(Pierce，美國)；核蛋白提取試劑盒(Pierce，美國)

1.2方法

1.2.1實驗動物 動物分組與模型制備：雄性Wistar大鼠30只，體重220～260 g，購于中山大學中山醫學院實驗動物中心。隨機分為對照組，DM 1 w組，DM 1個月組，每組大鼠10只。擬為DM模型組大鼠空腹12 h后按50 mg/kg腹腔一次性注射新配制STZ，72 h后大鼠尾靜脈采血測血糖，空腹血糖(FPG)≥16.7 mmol/L者作為大鼠DM模型建立標準。對照組大鼠腹腔注射等劑量的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液。實驗期間，所有大鼠分籠飼養，置于溫度(20±2)℃，濕度 55%～65%，每天12 h日光照維持，均常規飼料喂養、自由飲水。分別于造模后相應時間以鹽酸氯胺酮(2%，1 ml/100 g)麻醉后處死大鼠并分離大鼠股四頭肌，組織立即置于-80℃低溫冰箱保存。

1.2.2全RNA提取 準備：提取過程中所用的EP管、槍頭、容器等均用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)水浸泡12 h后高壓消毒。提取時需要佩戴口罩、帽子、手套，謹防RNA酶污染。取組織約100 mg，加入RNA提取液(TRIzol)1 ml研磨組織使其裂解，溶解于TRIZOL中，收集懸液于1.5 ml EP管中，加入200 ml氯仿，上下顛倒搖勻30 s，室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min離心15 min，可見液體分為三層，將上層移入另一EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒搖勻30 s，室溫靜置10 min。4℃，12 000 r/min離心10 min，棄去上清，加入75%酒精漂洗。4℃，7 500 r/min離心5 min，棄上清，將液體吸干，沉淀干燥，20 μl DEPC處理過的水溶解RNA。DNase I處理除去基因組 RNA含量及純度測定采用分光光度測定法：OD260/OD280約為2.0，OD260/OD230約為1.4。

1.2.3逆轉錄及實時定量PCR 以Taqman microRNA試劑盒及TAKARA 將所提取RNA逆轉錄至cDNA后進行 qPCR 反應。溫度設置為：起始模板變性95℃10 min；95℃變性15 s，60℃退火/延伸1 min，共40個循環。每例樣本均經三孔重復。microRNA27b，130(miR27b，130)以microRNA RNU6作為內部參照，PPARγ以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內部參照。計算機分析獲得樣本及內參的Ct值。mRNA相對值=2-ΔΔCT。

1.2.4核蛋白提取及電泳遷移率實驗(EM-SA) 取組織約100 mg，使用核蛋白提取試劑盒提取核蛋白，實驗步驟按試劑盒說明書進行。以二喹啉甲酸(BCA)法檢測上清液中核蛋白濃度，核蛋白于-80℃保存待用。

使用LightShiftTM Chemiluminescent EMSA試劑盒進行凝膠遷移實驗，檢測PPAR結合能力檢測。抽提核蛋白步驟，TRBP探針由上海生物工程生物制品有限公司合成、純化，序列為5′-CGAACGTGACCTTTGTCCTGGTCC-3′，并在5 端標記生物素。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1大鼠體重、血糖的變化 DM各組大鼠的FPG均在≥16.7 mmol/L。與對照組相比，1 w時DM組大鼠血糖顯著增高，1個月時DM組大鼠體重、血糖差異均有統計學意義(均P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠體重、血糖的變化

2.2miR27b、miR130、PPARγ在大鼠骨骼肌的表達 與對照組相比，DM組大鼠骨骼肌中miR20b的RNA水平表達明顯增加(P<0.01)，miR130的RNA水平表達顯著降低(P<0.01)；同時PPARγ的mRNA顯著降低(P<0.01)，且隨著時間延長增加趨勢越明顯。見圖1。

與對照組比較：1)P<0.05

2.3大鼠骨骼肌中PPAR結合能力改變 EM-SA電泳條帶灰度分析,與對照組相比，糖尿病組大鼠骨骼肌中PPAR的DNA結合能力也顯著降低(P<0.01)，且隨著時間延長增加趨勢越明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠骨骼肌中PPAR結合能力

2.4DM組大鼠血糖與miR27b及miR130相關性研究 以于對照組相比，miR27b、miR130在大鼠骨骼肌的相對RNA表達水平同大鼠血糖水平進行相關性分析。DM組大鼠血糖水平與miR27b的RNA水平存在負相關(R=-0.918，P<0.01)，與miR130存在正相關(R=0.833，P<0.01)。見圖3，圖4。

圖3 DM組大鼠血糖與miR27b相關性研究

圖4 DM組大鼠血糖與miR130相關性研究

3 討 論

PPARγ屬于核受體超家族，是包括PPARα和PPARβ/δ在內的NR1C亞類中的成員之一〔7〕。NR1C亞類中的這些受體與維甲酸類X受體(RXR)形成異二聚體，結合于特異的DNA序列而使靶基因激活從而調節目的基因的轉錄。PPARγ活化后可能影響到其他組織，PPARγ的選擇性配體不僅能有效降低如骨骼肌的葡萄糖利用，還可調節由脂肪組織分泌的一些特殊信號分子，如腫瘤壞死性因子(TNF-α)、瘦素(Leptin)等，這些產物反過來又可調節其他組織的糖代謝〔8〕。本研提示在DM大鼠1 w時活性就明顯降低，且隨著病程的延長、血糖增高加重而持續，也證實了PPARγ 參與了血糖調節紊亂的發生和發展。

研究表明一個microRNA家族可能結合至多達200個靶基因，而microRNA可能調控約30%的基因，從而參與多種病理和生理過程。PPARγ受多種microRNA調節，miR27b、miR130可通過影響PPARγ基因轉錄調控脂肪細胞生成分化〔9〕。本研究提示miR27b、miR130可能通過調節PPARγ參與DM過程中血糖調節作用。

T2DM過程中，microRNA表達增加，伴隨明顯PPARγ抑制能明顯促進其他靶基因的轉錄。本研究揭示了microRNA參與PPARγ轉錄激活調節的新機制。與此一致的是，由于RXR同樣在PPARγ的轉錄激活過程中發揮了重要作用，microRNA對RXR與PPARγ相互作用的影響機制有待進一步研究。

綜上，microRNA 可通過調節PPARγ參與DM的發生、發展，并且隨著對microRNA調控基因表達的研究逐步深入，這種調控機制將在DM預防及治療中發揮重要作用，也幫助我們理解高等真核生物的基因組繁雜的功能及復雜的基因表達調控網絡。

4 參考文獻

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8Lee EK，Lee MJ，Abdelmohsen K，etal.miR-130 suppresses adipogenesis by inhibiting peroxisome proliferator-activated receptor gamma expression〔J〕.Mol Cell Biol，2011；31(4)：626-38.

9Kravchenko NA，Iarmysh NV.The role of PPARs and their isoforms in metabolic disorders related to insulin resistance and diabetes〔J〕.Tsitol Genet，2011；45(3)：68-78.