益氣養陰消牴通絡中藥對早期糖尿病大鼠腎組織Podocin基因表達的影響

張江華 陳志強 趙雯紅 孫玉鳳 王月華 李黎莉 王鳳麗 楊增芯

(河北醫科大學中西醫結合研究所，河北 石家莊 050017)

糖尿病腎病 (DN)是糖尿病(DM)全身微血管并發癥之一。在DM中的發病率高達47.66%，是造成慢性腎衰竭的常見病因，占DM患者死亡率的60%，且發病率呈逐年上升趨勢〔1〕。迄今為止，尚無有效的方法能夠防止其發生和惡化。課題組針對DN的病因病機，提出了益氣養陰、消牴通絡治療大法，臨床取得了較好療效，顯示了較好的腎臟保護作用〔2～5〕，本研究進一步探討其防治DN的作用機制。

1 資料與方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠， 110只， SPF級，體重為(250±20)g，動物一般狀態良好，由河北醫科大學實驗動物中心提供。動物合格證編號：905042。益氣養陰、消牴通絡中藥(由黃芪、積雪草、丹參、茯苓、熟地、地龍、水蛭、鱉甲、大黃、砂仁等組成)，由河北醫科大學附屬河北省中醫院中藥房提供。符合國家藥典標準(2000年版)，中藥湯劑由本實驗室制備，濃縮至含生藥1 g/ml，分裝滅菌， 4℃保存備用。厄貝沙坦片(安博維)，150 mg/片，杭州賽諾菲圣德拉堡民生制藥有限公司生產，批號0809155。鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司。反轉錄cDNA試劑盒、Taq酶、dNTP(Fermentas公司)。大鼠Podocin引物(上海捷瑞生物工程有限公司)。代謝籠(蘇州工業園唯亭姑秀動物實驗設備廠)；OneTouchUltraⅡ穩豪型血糖儀(美國強生公司)；全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)；電子天平(德國賽多利電子天平有限公司)；PCR儀(英國ThorhnoHybaid公司)；三洋低溫冰箱(日本三洋電機株式會社)；電腦三恒電泳儀(北京六一儀器廠)；電子顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.2方法

1.2.1動物模型制備 大鼠適應性飼養1 w后，分別測定尿蛋白陰性后腹腔注射1%戊巴比妥鈉進行麻醉，常規備皮消毒，經背部切口行左腎切除術，并于傷口處滴0.01 ml慶大霉素以預防感染。2 w后除腎切組外，剩余大鼠腹腔注射STZ(40 mg/kg)，將其溶于0.1 mol/L，pH 4.4的枸櫞酸緩沖液中)， 72 h后尾靜脈取血，血糖大于16.7 mmol/L為造模成功〔6〕。

1.2.2動物分組及給藥方法 隨機抽取10大鼠只為單純腎切組，其余100只制備模型。造模期間有8只大鼠死亡，4只大鼠血糖偏低，從實驗中剔除。造模成功的88只隨機分為5組：模型組24只、厄貝沙坦組16只、中藥低劑量組16只、中藥中劑量組16只、中藥高劑量組16只。厄貝沙坦組大鼠給予厄貝沙坦15 mg·kg-1·d-1灌胃，中藥低、中、高劑量組大鼠分別給予中藥5.29、10.58、21.16 g·kg-1·d-1灌胃，余組給予等劑量生理鹽水灌胃藥物劑量換算按體表面積換算〔7〕，每日灌胃1次。動物自由進食、飲水，室溫18℃～20℃，相對濕度40%～70%，12 h交替照明，共給藥6 w。實驗期間每天測量1次尾靜脈血糖，對血糖≥26.0 mmol/L可能危及生存的大鼠皮下注射適量長效胰島素(0.5～4 U)，使血糖維持在16.7 mmol/L以上，并避免酮癥，減少死亡。

1.2.324 h UPro及腎功能檢測 于第6周末用代謝籠留取24 h尿液，記錄總量，雙縮脲法檢測各組大鼠24 h尿蛋白(UPro)量。實驗結束時，所用動物于空腹狀態稱體質量，3%戊巴比妥鈉麻醉，股動脈取血，全自動生化分析儀(美國貝克曼公司)檢測血清肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平；分離腎臟，用冰生理鹽水沖洗，吸干水分，稱腎質量，計算腎臟肥大指數(腎質量/體質量)。腎皮質液氮速凍后存放于-70℃冰箱，用于RT-PCR檢測。

1.2.4RT-PCR檢測腎皮質Podocin的表達 采用Trizol法提取腎皮質總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄cDNA。Podocin上游引物：5′-AGCGAATCAGCACCTACGGACTTC-3′，下游引物：5′- GGTTCCACTCCACCAGCCTTCTTC-3′，擴增產物大小為200 bp； 內參照為GAPDH：上游引物：5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′，下游引物：5′-ACCACAGTCCATGCCA-TCAC-3′，擴增產物大小為452 bp。PCR反應條件： 95℃ 5 min；94℃ 30 s；退火溫度分別為57.8℃、62.9℃ 30 s，72℃30 s；擴增30個循環，最后72℃ 7 min。取PCR產物行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。應用凝膠圖像分析系統測定灰度值，以GAPDH基因表達量為內參照，以目的產物與GAPDH的灰度比值表示mRNA相對含量。

2 結 果

2.1一般情況 腎切組大鼠精神良好，飲食正常，反應靈敏，皮毛光澤，肌肉豐滿，糞便呈麥粒狀，尿量正常。其余組注射STZ后，均出現明顯的多飲、多食、多尿癥狀，并逐漸出現精神萎靡，反應遲鈍，少動抱團，部分大鼠出現全身感染、潰瘍等并發癥。其中12只大鼠血糖未達標準，剔除。上述癥狀以模型組最為顯著。治療期間造模各組均有大鼠死亡情況，其中中藥低劑量組死亡3只，中藥高、中劑量、厄貝沙坦組各死亡4只，模型組死亡10只，死亡原因估計為高血糖引起的代謝紊亂最終導致臟器衰竭。

2.2各組大鼠24 hUPro的比較 與單純腎切組〔(8.05±1.20)mg/24 h〕比較，模型組、各治療組UPro升高(P<0.05)；與模型組〔(54.75±11.16)mg/24 h〕比較，厄貝沙坦、中藥低、中劑量組UPro下降〔(24.33±8.43)mg/24 h、(26.71±7.36)mg/24 h、(33.36±5.32)mg/24 h，P<0.05〕，中藥高劑量組UPro無統計學意義〔(64.12±3.18)mg/24 h，P>0.05〕，厄貝沙坦、中藥低、中劑量組之間比較無統計學意義(P>0.05)，說明厄貝沙坦、中藥低、中劑量可顯著降低糖尿病大鼠24 h UPro，且三組之間無明顯差別。

2.3各組大鼠腎功能的比較 與單純腎切組比較，模型組Scr、BUN值升高(P<0.01)，各治療組Scr值無統計學意義(P>0.05)，BUN值升高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組Scr值下降(P<0.05)，中藥低、高劑量組BUN值下降(P<0.05)，余組BUN值無統計學意義(P>0.05)，說明厄貝沙坦和各劑量中藥對DN大鼠的腎功能損害均有明顯的改善作用。見表1。

2.4對大鼠腎臟Podocin mRNA表達的影響 與單純腎切組比較，模型組Podocin表達下降(P<0.05)，其余組無顯著差異(P>0.05)。與模型組比較，中藥低劑量組Podocin表達顯著增加 (P<0.01)；中劑量組、厄貝沙坦組Podocin表達均上升(P<0.05)；說明厄貝沙坦、中藥中、低劑量組可上調Podocin mRNA表達。見圖1，表2。

表1 各組Scr、BUN水平的比較

1.腎切組； 2.模型組； 3.厄貝沙坦組； 4.中藥低劑量組； 5中藥中劑量組； 6.中藥高劑量組

表2 各組大鼠腎臟Podocin mRNA表達

3 討 論

DN是DM病人死亡的主要原因，大量蛋白尿的發生是DM腎組織損傷的典型標志。目前已經形成共識，即UPro的發生與腎小球濾過屏障異常有密切關系。腎小球濾過屏障包括三層：內皮細胞窗孔、腎小球基底膜(GBM) 以及位于臟層上皮細胞足突之間的裂孔隔膜。而裂孔隔膜是濾過屏障中最主要的部位，可以阻止絕大部分蛋白質漏出到原尿中，故與蛋白尿的發生密切相關〔8〕。近年來已經先后確定了多個由足細胞表達、對維持正常裂孔隔膜功能十分重要的分子成分。其中Podocin是2000年Boute等〔9〕通過定位克隆技術研究發現的新發夾樣結構的整合膜蛋白，由NPHS2基因編碼，以寡聚體的形式特異性地表達于足細胞SD處。除了作為正常足細胞SD的一種重要的結構蛋白，也有研究發現Podocin集中位于足突之間的緊密連接位點上，可能發揮一種支架的作用將緊密連接蛋白與足細胞的肌動蛋白相連〔10〕。因此觀察足細胞Podocin變化對于糖尿病腎病蛋白尿的發生和發展至關重要。

DN屬于中醫學“消渴病”、“腎消”、“虛勞”、“水腫”、“關格”等范疇， 目前對于DN的病機認識主要是認為本病為本虛標實之證，以脾腎及氣血陰陽之虛為本，氣滯、濕阻、血瘀、痰聚為標。腎為先天之本，主藏精，司固攝而寓元陰元陽，脾虛日久累及腎元，腎失固攝，則水谷精微下泄，臨床表現為蛋白尿及尿糖增高。氣為血帥，氣行血行，氣滯則血瘀、津停，痰瘀互結，瘀阻脈絡，久釀成牴積是其關鍵環節。故擬益氣養陰、消牴通絡中藥復方為治療DN的基礎方，該中藥復方經臨床及實驗研究證明療效確切〔11，12〕。其中黃芪益氣，走而不守，配伍茯苓、砂仁、熟地，氣陰兼顧，健脾益氣，補腎斂精，利水消腫；水蛭性緩則氣血不傷，善入則堅積易破，配伍地龍、鱉甲，活血祛瘀，散結軟堅；大黃同煎，可通腑泄熱，蕩滌積滯，使濁邪從下竅而出；積雪草有清熱利濕、消腫解毒之功效。諸藥合用，共奏補脾益腎，益氣養陰，活血化瘀，利水泄濁之功，使扶正不留邪，祛邪不傷正。另據現代藥理研究發現益氣養陰、消牴通絡中藥〔13～16〕能改善腎小球濾過屏障，減輕通透性蛋白尿，抑制血栓形成，降低血小板黏附率，改善DN的血液流變學，延緩DN的發展，保護腎功能。

本實驗結果表明中藥中、低劑量可顯著減少DN大鼠尿蛋白，各劑量均能降低Scr、BUN水平，與厄貝沙坦比較降UPro作用相當，改善腎功能略好，需進一步研究二者的協同效應。本實驗提示益氣養陰、消牴通絡中藥可能通過減少Podocin蛋白的丟失，使腎小球濾過膜的完整性得到一定程度的恢復而減輕蛋白尿，但中藥短期干預無劑量依賴性，其長期療效發揮有待進一步研究。

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