電針對帕金森病大鼠的治療作用及對基底節輸出核團活性的影響

張雪梅 楊 芳 邢國慶

(泰山醫學院機能學實驗室，山東 泰安 271000)

針灸能改善帕金森病(PD)患者的癥狀，提高其生活質量〔1〕；但由于臨床針灸研究工作的局限性，無法進行系統、準確的觀察和分析，影響了對針灸治療PD的療效評價，同時也缺乏對針灸治療PD機制的深入研究。在針灸治療PD動物模型的研究報道中已經揭示〔2～4〕，高頻電針刺激能有效改善PD模型動物的異常行為，并能保護多巴胺(DA)能神經元，抑制炎癥反應和氧化應激反應，增加神經營養因子等的作用。PD運動癥狀的產生與基底神經節環路關系密切，因此調整基底神經節環路的功能可能是揭示針灸改善PD運動癥狀的機制所在。本實驗擬在線刀切斷內側前腦束(MFB)的模型大鼠上，通過檢測電針對紋狀體內的酪氨酸羥化酶(TH)免疫組織化學的變化來證實電針的治療作用，分別在蒼白球和腹側中腦部位檢測谷氨酸脫羧酶(GAD)67蛋白水平的改變，來探究電針是否通過對基底節輸出核團γ-氨基丁酸(GABA)能神經元活性的調控而發揮治療效應，以深入了解電針治療的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 實驗用Wistar雄性大鼠24只，體重200～250 g，由山東省中醫藥大學動物中心提供〔合格證號:SCXK(魯)20050015-0001684〕。每籠4只群養，12 h/12 h晝夜循環照明，自由飲水和進食。主要藥品和儀器如下：阿撲嗎啡(APO,Sigma公司)，小鼠單克隆抗TH抗體(Sigma公司)，GAD67抗體：小鼠抗GAD67單克隆抗體(CHEMICON公司)；大鼠腦立體定位儀、可伸縮線刀(美國KOPF公司)，大鼠旋轉行為記錄儀(美國Columbus Instruments)。

1.2模型制備與處理 機械損傷MFB建立單側PD模型〔5〕。動物用水合氯醛(350 mg/kg，i.p.)麻醉后，固定于大鼠腦立體定位儀上。Scoutern 線刀在立體定位儀的引導下，切斷MFB，定位坐標為：前囟后3.5 mm，矢狀線右側旁開2.5 mm，硬膜下7.5 mm，得到單側損傷的PD大鼠模型。動物隨機分為假手術組、模型組和電針治療組，每組大鼠數量在8只以上。術后第2天開始電針治療，選取百會和大椎穴位，用HANS電針儀，施加逐級增強的電流強度，1、2和3 mA各持續10 min，共計30 min，1次/d，連續6 d為1個療程，第7天進行行為學檢測，共治療4個療程。

1.3檢測指標 異常旋轉行為的檢測是將大鼠穿上束縛套后置于測試儀中，皮下注射APO(0.5 mg/kg)后記錄大鼠誘發出現的旋轉行為，計算大鼠在單位時間內的凈旋轉次數。黑質網狀部的神經元主要是支配丘腦的GABA能投射神經元，檢測中腦部位的GAD67的表達，能反映中腦部位尤其是黑質網狀部GABA能神經元的活性。對各組大鼠在電針治療28 d后，取腹側中腦部位組織，用Western印跡檢測中腦GAD67表達的變化。Western印跡檢測中腦GAD67含量，一抗為鼠抗GAD67抗體(1∶500)，并加入用于作為內參的小鼠抗β-actin抗體，4℃孵育過夜。羊抗小鼠二抗(1∶3 000)孵育2 h后PBS洗去膜，成像系統進行掃膜。組化染色方法檢測TH及GAD67形態改變，對大鼠灌流固定取全腦，冰凍切片厚度30 μm，分別進行染色后拍照。

2 結 果

2.1電針對PD模型大鼠異常旋轉行為的影響 模型組大鼠在術后第1周起就能產生由(APO)誘發的向未損傷側(左側)的異常旋轉行為，并呈進行性加重趨勢；在第4周起，模型組大鼠的異常旋轉行為與假手術組相比明顯增多，而電針治療可以明顯降低PD大鼠的異常旋轉行為。

2.2電針對PD模型大鼠紋狀體內TH免疫反應陽性纖維的影響 PD大鼠在損傷側紋狀體內TH陽性纖維丟失比較明顯，其損傷側/未損傷側的TH陽性纖維比值只有假手術組的34.7%(P<0.01)，電針治療組的TH陽性纖維的光密度值明顯增加，相對于模型組的纖維光密度值增加了45%(P<0.01)，表明電針治療能減緩MFB損傷側的TH陽性纖維的丟失，具有一定的神經保護效應。見圖1。

2.3電針對GAD67蛋白在腹側中腦表達的影響 MFB損傷側中腦部位的GAD67表達含量顯著增加，與假手術組相比較顯著增加(P<0.01)。電針治療能降低中腦部位的GAD67的過表達，與模型組相比較有顯著增加(P<0.05)，提示電針治療能降低中腦部位的GAD67的表達增多，電針降低了黑質網狀部的GABA能神經元的活性。見圖2。

圖1 各組大鼠紋狀體內TH免疫組化表達(DAB,×40)

圖2 Western印跡檢測中腦GAD67表達

2.4電針對蒼白球內GAD67陽性神經纖維分布的影響 模型組損傷側蒼白球內的GAD67陽性纖維染色出現增強，電針治療對這種增強沒有明顯影響；定量分析，模型組比假手術組的光密度值高出38%(P<0.05)；而電針治療組與模型組的光密度值相比沒有明顯區別(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠腦蒼白球內GAD67免疫組化表達(DAB，×40)

3 討 論

PD是中樞神經系統的一種神經退行性疾病，其病理變化主要是中腦黑質致密部(SNc)DA能神經元出現漸進性丟失，導致靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩等為特征的臨床癥狀。

有研究表明〔3〕，電針治療能明顯緩解機械損傷MFB的PD模型中黑質部位DA能神經元的變性，可能是電針通過增加腦內營養因子的表達，而對DA神經元產生營養而具有保護作用。本研究結果提示，電針也能夠緩解PD的異常旋轉行為，同時對來自于黑質部位的DA能神經元投射到紋狀體內的TH陽性神經纖維也具有一定的神經保護作用。本研究結果與以前的研究類似，均證實了電針的治療效應。

基底神經節屬于皮層下的結構，與運動功能、學習和記憶等功能都有關聯〔6〕。在基底節中，紋狀體接受來自皮層和丘腦的谷氨酸能(GLU)的傳入，再通過兩條通路發出GABA能投射到基底節的主要輸出核團(SNr)和蒼白球內側核(GPi)，輸出核團再調節丘腦的活性實現對運動的調控。基于這樣的結構組成，SNr神經元的活性應該主要是受到GABA 和GLU 相互平衡的調節控制。然而，Windels等〔7〕用電生理和微電泳的實驗證實，調節SNr神經元活性的主要因素是GABA能的傳入，而不是GLU和GABA相互對抗作用的結果。這一假說進一步被實驗驗證，即向SNr內移植可釋放GABA的工程細胞，顯著減少PD大鼠模型的下頜震顫，其改善癥狀的原因就是GABA通過對SNr的神經元活性進行調節而發揮作用〔8〕。SNr神經元接受來自紋狀體、蒼白球及SNr內相鄰細胞軸突的GABA能傳入，這些GABA傳入的作用就是抑制了SNr神經元的活性。以上均提示本實驗需要進一步關注GABA等神經遞質對PD運動癥狀的調節效應及其對DA能神經元的影響。

在PD狀態下，由于紋狀體DA的減少，經過基底節環路傳導的結果之一就是基底節輸出核團的神經元過度活躍〔9〕。因此，藥物、手術損毀或電刺激等對PD患者的治療，可能都是通過影響SNr或GP神經元的活性來發揮療效的。本實驗結果揭示出電針能抑制基底節輸出核團SNr神經元在損傷時的過度活躍，從而增加丘腦的興奮性，得以改善PD癥狀。

有實驗也證實〔10〕，在PD動物模型中蒼白球GABA的釋放增加，或蒼白球投射到SNr和EP的神經元表達的GAD67 mRNA也都有增加，及蒼白球神經元的放電增加。這些結果提示蒼白球的功能比較復雜，并不單純是由紋狀體蒼白球通路的過渡活躍所致蒼白球神經元的活性降低。此外，蒼白球也受到底丘腦核的GLU興奮性投射增加其活性，以及紋狀體蒼白球通路末梢的ENK也可以產生突觸前抑制作用，減少了紋狀體蒼白球通路末梢GABA的釋放〔11〕。本實驗未能檢測到電針對蒼白球內GAD67染色的改變，可能是多種因素的相互干預。

本實驗結果初步提示電針可產生行為改善效應，并且這種作用可能是通過抑制了基底節輸出核團神經元的活性而實現的，而進一步的工作尚需充分驗證。

4 參考文獻

1Cristian A,Katz M,Cutrone E,etal.Evaluation of acupuncture in the treatment of Parkinson's disease:a double-blind pilot study〔J〕.Mov Disord，2005；20(9):1185-8.

2Liang XB,Liu XY,Li FQ,etal.Long-term high-frequency electro-acupuncture stimulation prevents neuronal degeneration and up-regulates BDNF mRNA in the substantia nigra and ventral tegmental area following medial forebrain bundle axotomy〔J〕.Brain Res Mol Brain Res，2002；108(1-2):51-9.

3Liang XB,Luo Y,Liu XY,etal.Electro-acupuncture improves behavior and upregulates GDNF mRNA in MFB transected rats〔J〕.Neuroreport，2003；14(8):1177-81.

4Liu XY,Zhou HF,Pan YL,etal.Electro-acupuncture stimulation protects dopaminergic neurons from inflammation-mediated damage in medial forebrain bundle-transected rats〔J〕.Exp Neurol，2004；189(1):189-96.

5Knusel B,Beck KD,Winslow JW,etal.Brain-derived neurotrophic factor administration protects basal forebrain cholinergic but not nigral dopaminergic neurons from degenerative changes after axotomy in the adult rat brain〔J〕.J Neurosci，1992；12(11):4391-402.

6Alexander GE，Crutcher MD.Functional architecture of basal ganglia circuits:neural substrates of parallel processing〔J〕.Trends Neurosci，1990；13(7):266-71.

7Windels F，Kiyatkin EA.GABA,not glutamate,controls the activity of substantia nigra reticulata neurons in awake,unrestrained rats〔J〕.J Neurosci，2004；24(30):6751-4.

8Carlson BB,Behrstock S,Tobin AJ,etal.Brain implantations of engineered GABA-releasing cells suppress tremor in an animal model of Parkinsonism〔J〕.Neuroscience，2003；119(4):927-32.

9Wichmann T,Bergman H,Starr PA,etal.Comparison of MPTP-induced changes in spontaneous neuronal discharge in the internal pallidal segment and in the substantia nigra pars reticulata in primates〔J〕.Exp Brain Res，1999；125(4):397-409.

10Chesselet MF，Delfs JM.Basal ganglia and movement disorders:an update〔J〕.Trends Neurosci，1996；19(10):417-22.

11Stanford IM，Cooper AJ.Presynaptic mu and delta opioid receptor modulation of GABAA IPSCs in the rat globus pallidus in vitro〔J〕.J Neurosci，1999；19(12):4796-803.