吡格列酮對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的神經保護作用機制

余 智 廖小明 唐永剛 齊 立 孫 軍 劉開祥

(杭州市淳安縣第一人民醫院神經內科，浙江 杭州 311700)

吡格列酮(PGZ)是一種人工合成的胰島素增敏劑噻唑烷二酮類藥，臨床上廣泛應用于2型糖尿病的治療。目前有報道提示PGZ能通過激活PPARγ抑制炎癥等過程，從而對腦缺血再灌注損傷具有一定的神經保護作用〔1〕。但關于PPARγ激動劑的神經保護作用機制尚未完全闡明。本實驗采用大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，應用PGZ進行預處理，觀察其對大鼠術后神經功能及腦含水量、炎癥反應和細胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1動物分組 清潔級SD雄性大鼠120只，重量250～280 g。術前12 h禁食不禁水，隨機(隨機數字法)分為5組，每組各24只：①假手術組；②模型組；③PGZ組；④GW9662+PGZ組(GP組)；⑤二甲基亞砜(DMSO)組。

1.2試劑 PGZ、GW9662和10% DMSO(Sigma公司，美國)；核轉錄因子(NF)-κB及干擾素(IFN)-γ ELISA試劑盒(R&D Systems公司，美國)；甲苯胺藍(國藥集團)、原位末端標記(TUNEL)試劑盒(Promega公司)；Labo fuge 400R高速低溫離心機(Heraeus公司，德國)，多功能酶標儀(BioTek公司，美國)，電子顯微鏡(OLYMPUS，日本)等。

1.3動物模型制備及處置 模型組：術前45 min經尾靜脈注射生理鹽水2 ml/kg，采用改良的Zea-Longa〔2〕法制備大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)模型：麻醉成功后，取頸部左旁正中切口，暴露左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，結扎并游離ECA的近端，將蛙心夾夾閉CCA和ICA后在ECA游離段上剪開一個小口將制備好的尼龍線栓經CCA分支處通過ICA入顱，線栓深度為18～19 mm。缺血90 min后抽出線栓即可造成再灌注模型。PGZ組：術前45 min經尾靜脈注射PGZ10 mg/kg。GP組：術前45 min先經尾靜脈注射GW9662，劑量是0.3 mg/kg〔3〕，10 min后再經尾靜脈注射吡格列酮10 mg/kg。D組：術前45 min經尾靜脈注射10%DMSO 2 ml/kg。假手術組：術中分離左側CCA、ICA及ECA，但不做任何缺血處理。

1.4指標檢測

1.4.1神經功能評分 再灌注24 h后采用雙盲法嚴格按Zea-Longa 5分法進行神經功能評分。

1.4.2腦含水量檢測 再灌注24 h后隨機抽取各組8只大鼠，立即斷頭取腦，去除小腦及低位腦干后快速用精密天平稱取濕重，然后烘至恒重，稱取干重，將(濕重-干重)/濕重×100%作為腦含水量的指標。

1.4.3NF-κB及IFN-γ含量水平測定 再灌注24 h后，各組再隨機抽取8只大鼠，迅速斷頭取腦。于冰上在距額葉前端3 mm和9 mm處進行冠狀分離，取中間6 mm厚的腦組織塊，然后沿此腦塊矢狀縫兩側約2 mm處，從上至下切去兩側半球的正中結構，將左側腦塊作為缺血腦組織。嚴格按ELISA試劑盒檢測要求進行操作。

1.4.4HE染色 將各組其余8只大鼠麻醉，以4℃生理鹽水進行心臟快速灌洗，予多聚甲醛灌洗充分固定，并以同樣的方法取得缺血腦組織，制成蠟塊。自前往后連續冠狀位切片，厚約5 μm。HE染色光學顯微鏡下(×400)觀察神經細胞形態學變化并采圖。

1.4.5尼氏染色及TUNEL染色 嚴格按照試劑盒檢測步驟進行操作。尼氏染色在光鏡(×400)下觀察健存神經元(以尼氏小體為代表)的數量，計算尼氏小體的數目/相應的面積并采圖。TUNEL染色在光鏡下(×400)觀察凋亡細胞(以胞核出現棕黃染色顆粒代表)，計算TUNEL陽性率即TUNEL陽性細胞數占總細胞數的比值并采圖。

2 結 果

2.1各組大鼠一般狀況及神經功能 與模型組相比，經PGZ預處理的大鼠神經功能評分明顯降低(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠一般狀況及神經功能(n=24)

2.2腦組織含水量 與模型組相比，PGZ組大鼠含水量明顯降低(P<0.01)。5組大鼠腦組織含水量的比較見表2。

2.3NF-κB、IFN-γ含量水平及相關性分析 與模型組比較，PGZ組大鼠NF-κB及IFN-γ含量水平均顯著降低(P<0.05)。兩組腦組織NF-κB與IFN-γ含量水平均呈顯著正相關，回歸方程模型組=-0.432+0.271x，rM=0.947(P<0.001),PGZ組=-4.168+0.748x，rP=0.961(P<0.001)。見表2。

2.4HE染色 切片經HE染色后，光鏡下可見模型組呈明顯的缺血損傷性改變，多數細胞體積縮小，正常組織結構消失，胞質疏松，胞核固縮深染，部分細胞壞死。PGZ組缺血性損傷改變較模型組明顯減輕，細胞膜較完整，間質水腫減輕，壞死區域縮小。

2.5尼氏染色及TUNEL染色 假手術組尼氏小體多且體積大，呈紫色分布于核周圍，且只有少量凋亡細胞。模型組尼氏小體數量明顯減少，且變小或變形〔(63.06±9.05)%〕，而PGZ組相應區域尼氏體數量較多且變形較少〔(48.10±7.61)%〕,兩組相比差異也有統計學意義(P<0.01)。見表2，圖1。

表2 各組大鼠腦組織含水量、 NF-κB、IFN-γ含量、尼氏小體平均數值及凋亡細胞數

A：假手術組 B：模型組 C：PGZ組 D：DMSO組 A1：假手術組 B1模型組 C1：PGZ組 D1：DMSO組(A～D:尼氏小體染色；A1～D1：TUNEL染色)

3 討 論

近期研究表明，腦缺血再灌注時神經細胞釋放大量炎癥信號，介導大量炎性細胞的聚集和炎性因子的釋放〔4〕，加重缺氧直接造成的神經元壞死和凋亡，從而放大對缺血損傷區域細胞甚至是機體的損傷。本研究也已證實，減輕炎癥反應可抑制腦缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡〔5〕。炎癥反應的要素包括信號傳導分子、炎癥細胞、黏附分子和轉錄因子。NF-κB屬于NF-κb/Rel家族蛋白的一員，能夠啟動基因轉錄，從而參與一系列基因的調控和表達，在炎癥反應、免疫應答、細胞凋亡調控等方面發揮重要作用。本實驗結果表明腦缺血后誘導釋放NF-κB而促進IFN-γ的表達。本實驗結果與Xu 等〔6〕研究報道基本一致。此外，有研究表明IFN-γ可活化P38激酶，誘導細胞因子及Ⅱ類組織相容性復合體(MHC)的表達，共同參與細胞的凋亡〔7〕。本研究也發現模型組中IFN-γ的含量水平及細胞凋亡數量相比假手術組顯著升高，我們推測IFN-γ在腦缺血再灌注損傷后形成細胞凋亡過程中發揮至關重要的作用。

有研究發現，PPARγ激動劑能活化細胞外信號調節激酶而抑制NF-κB的激活〔8〕。國內有研究報道，PGZ作為PPARγ特異性激動劑，可促進PPARγmRNA和蛋白的表達，增強其對腦缺血再灌注損傷的神經保護作用〔9〕。本實驗發現PGZ可通過降低誘發NF-kB的釋放能力，進而減少促炎介質(IFN-γ)的含量水平，從而發揮增加健存神經元而減少細胞凋亡的作用；若先給予GW9662〔10〕后再予PGZ處理，則可逆轉PGZ的上述保護作用；同樣，單獨行DMSO預處理后的大鼠在相關方面未得到明顯的改善。

本文提示PGZ具有阻止或延緩神經細胞水腫壞死，對保護缺血再灌注后神經細胞損傷具有積極意義，而GW9662則可逆轉PGZ抗細胞水腫壞死的效應。

本研究結果表明，吡格列酮可通過激活PPARγ負性調節腦組織中NF-κB的含量水平，進一步減少促炎介質(IFN-γ)的釋放，減輕了大鼠缺血再灌注后的細胞水腫，從而很好地增加健存神經元而減少細胞凋亡。

4 參考文獻

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