TLR4對人乳腺癌細胞MCF-7放射敏感性的影響

王 宏 張海鵬 盧良杰 范志民

(吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

Toll樣受體(TLRs)是一類重要的模式識別受體，TLRs最初被認為是固有免疫系統(tǒng)所特有，但很多學者發(fā)現(xiàn)，TLRs也表達于腫瘤細胞〔1,2〕。其中以TLR4的腫瘤表達最為廣泛，且表達豐度較高，因而TLR4在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中作用備受關注〔3,4〕。腫瘤細胞TLR4的激活可以促進細胞的增殖和凋亡抵抗〔5〕。TLR4在乳腺癌中的表達及其對乳腺腫瘤生物學行為以及對腫瘤細胞放射敏感性的研究報道甚少。因此，本研究在以往研究腫瘤細胞輻射效應機制的基礎上，進一步探討TLR4對人乳腺癌細胞放射敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1細胞株培養(yǎng) 人乳腺癌細胞株MCF-7購自上海細胞庫，用RPMI1640培養(yǎng)基(內(nèi)含10%的胎牛血清及青霉素與鏈霉素各100 U/ml)、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。均用0.25%胰酶消化貼壁細胞并傳代。

1.2主要試劑 RPMI1640培養(yǎng)基、標準胎牛血清購自美國Clone公司；內(nèi)毒素脂多糖(LPS)購自美國Sigma公司；TAK242購自上海佰世凱化學科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；Annexin V-FITC/PI雙染色法流式細胞檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；抗小鼠TLR4抗體購自美國R&D公司；FITC標記兔抗山羊IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3照射條件及實驗分組〔6〕國產(chǎn)X.S.S.205(FZ)型固定式X射線深部治療機(丹東市康嘉儀器設備有限公司)，電壓180 kV，電流18 mA，濾板0.5 mmCu+1.0 mmAl。單次照射劑量為5 Gy，源靶距60 cm，劑量率0.387 Gy/min。取對數(shù)生長期的腫瘤細胞分為3組：①空白對照組：只加入PBS；②激動組(LPS組)：5 Gy照射前4 h單獨加入LPS，終濃度為1 μg/ml ；③阻滯組(TAK242組)：5 Gy照射前1 h單獨加入TAK242，終濃度為1 μg/ml。

1.4CCK-8試劑盒檢測腫瘤細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)消化制成單細胞懸液，調(diào)細胞濃度為4×104/ml，取100 μl加入96孔板中，細胞貼壁后按方法3進行實驗分組，每組設3復孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入CCK-8溶液10 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后終止。按照試劑盒說明書用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm處測定其吸光度(A)值，用于表示細胞相對增殖活性，增殖活性(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.5流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期細胞，用胰蛋白酶消化細胞，以每孔106個細胞接種于6孔板中培養(yǎng)，細胞貼壁后按方法3進行實驗分組，每組設4復孔，培養(yǎng)48 h后收集細胞，取5×105個細胞移入離心管，1500 r/min離心半徑13 cm，離心5 min，懸于1×Buffer中后1 500 r/min離心半徑13 cm，離心5 min，棄上清，每管依次加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，在室溫下反應15 min，用流式細胞儀檢測。Annexin V從FITC的綠色熒光通過FITC通道檢測；PI紅色熒光通過PI通道檢測。

1.6流式細胞術(FCM)檢測細胞周期 1×106個細胞經(jīng)胰酶消化制成單細胞懸液后，冰冷PBS洗滌2次，1 500 r/min離心半徑13 cm，離心5 min，棄上清，加入0.1 mg/ml的核糖核酸酶80 μl和5%碘化丙啶溶液150 μl，在4℃作用30 min，用流式細胞儀檢測細胞周期變化，用CellQuest軟件收取細胞(每份樣品收取1×104個細胞)，結(jié)果以百分率表示。

1.7克隆形成實驗檢測細胞輻射敏感性〔7〕將不同數(shù)量的細胞分別接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，按方法3分組處理。給予不同干預處理后，繼續(xù)培養(yǎng)10～14 d，集落形成后，棄培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加甲醇溶液固定15 min。棄固定液，加適量吉姆薩染色20 min，流水洗去染色液。倒置顯微鏡下計數(shù)各孔50個以上的集落數(shù)。按以下公式計算克隆形成率(PE,%)=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%，對照組克隆形成率設為100%，各組細胞存活分數(shù)=各組克隆形成率/對照組克隆形成率。

2 結(jié) 果

2.1TLR4對受照的MCF-7細胞增殖活性的影響 MCF-7受5 Gy照射后其增殖活性明顯低于照射前(P<0.05)，經(jīng)TLR4阻斷劑TAK242處理后，其增殖活性明顯降低(P<0.05)，而用TLR4激動劑LPS處理后，其增殖活性明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 TAK242和LPS對照射前后MCF-7細胞增殖活性的影響

2.2TLR4對受照的MFC-7細胞凋亡率的影響 用TAK242阻斷TLR4后，輻射誘導MFC-7細胞凋亡率明顯增多，而用LPS刺激后其凋亡率明顯受抑制(P<0.05)。見表2。

表2 TAK242和LPS對照射前后MCF-7凋亡率的影響

2.3TLR4對受照的MCF-7細胞周期變化的影響 MCF-7細胞受照后G2/M期細胞顯著多于對照組(P<0.01)，G0/G1期細胞明顯減少(P<0.01)，S期細胞變化不明顯(P>0.05)。見表3。

表3 TAK242和LPS對照射前后細胞周期的影響

2.4TLR4對受照的MCF-7細胞克隆形成的影響 MCF-7受5 Gy照射后其細胞存活數(shù)明顯低于照射前(P<0.01)，經(jīng)TLR4阻斷劑TAK242處理后，其細胞存活數(shù)明顯降低(P<0.01)，而用TLR4激動劑LPS處理后，其細胞存活數(shù)明顯升高(P<0.01)。見表4。

表4 TAK242和LPS對照射前后MCF-7細胞放射敏感性的影響

3 討 論

TLRs的分布十分廣泛,可以直接識別結(jié)合某些病原體或其產(chǎn)物所共有的高度保守的特定分子結(jié)構(gòu),即病原相關分子模式,可以對不同病原相關分子模式進行識別、結(jié)合,并引發(fā)一系列信號轉(zhuǎn)導,進而導致炎性介質(zhì)的釋放,在天然免疫防御中起著重要作用,并最終激活獲得性免疫系統(tǒng)〔8〕。目前發(fā)現(xiàn)的TLRs 家族至少已包括了12 個成員，不同的TLRs 其配體也有所不同,其中TLR4 是介導內(nèi)毒素/脂多糖應答的最主要受體。TLR4 幾乎分布于所有的細胞系,主要表達在參與宿主防御功能的細胞上,TLR4 信號轉(zhuǎn)導通路,與許多疾病的發(fā)生及發(fā)展過程相關,下游信號的級聯(lián)式反應往往會使疾病朝不良的方向轉(zhuǎn)歸〔9〕,因此臨床上研制各種阻斷或抑制TLR4 信號通路上各個節(jié)點藥物也是目前醫(yī)學領域研究的熱點。

乳腺癌是起源于乳腺腺上皮細胞的惡性腫瘤。目前已成為全球范圍內(nèi)嚴重影響女性身心健康及生活質(zhì)量的首要惡性疾病之一，且威脅患者生命。亞洲范圍內(nèi)我國屬于乳腺惡性腫瘤低發(fā)病國家，但不容樂觀的是我國每年患病率同樣以非常驚人的速度在增長，由于我國國土范圍較大，區(qū)域差異性更為明顯，沿海及京、津等大中型城市的乳腺癌患者數(shù)量龐大且病死率高，城鄉(xiāng)患者相對較少但發(fā)病率增長速度加快，患病人群逐漸呈現(xiàn)出年青化趨勢，乳腺癌目前手術治療后輔助放射治療是乳腺癌的重要治療手段。理論上電離輻射能夠殺傷腫瘤細胞，因此，現(xiàn)階段臨床多采用放療的方法進行惡性腫瘤的治療。但當放療條件一定的情況下，為了加大治療效果，繼續(xù)優(yōu)化放療射線物理劑量的分布就會受到一定的限制。Mittal等〔10〕報道，TLR4表達在輻射抵抗細胞上，其存在對腫瘤的致癌作用必不可少，同時也證明TLR4與放射敏感性密切相關。

在腫瘤的放射治療中，免疫細胞表面的TLR4信號誘導的炎性反應能影響宿主免疫應答，產(chǎn)生抗腫瘤免疫，從而幫助腫瘤細胞產(chǎn)生免疫逃逸〔11〕。然而，腫瘤細胞在受到輻射后可釋放內(nèi)源性配體，激活TLR4信號通路，刺激NF-κB產(chǎn)生，從而促進各種細胞因子的釋放，如IL-6，血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)等，促進腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，抑制凋亡，進而降低腫瘤的治療效果。因此，我們可以以TLR4為作用靶點選擇合適的藥物，抑制其反應通路，降低腫瘤細胞的放射抵抗，也可以通過其他途徑增強腫瘤細胞的放射敏感性，提高腫瘤放療效果。迄今對表達在人乳腺癌細胞上TLR4的研究甚少，因此，進一步研究和闡述TLR4對乳腺癌細胞的功能和生物學特性尤為重要。

細胞表面膜受體在感應電離輻射作用后，啟動的信號傳導過程可大體分為兩類，即細胞保護性通路和細胞毒性通路。前者與照射后細胞的抑制增殖有關；后者主要引起細胞凋亡〔12〕。本實驗結(jié)果顯示，應用TLR4信號通路抑制劑TAK-242阻斷后能明顯抑制受照MCF-7細胞的增殖，LPS能明顯促進MCF-7細胞的增殖；用TAK242阻斷TLR4后，輻射誘導MCF-7細胞凋亡率明顯增多而用LPS刺激后其凋亡率明顯受抑制；阻斷TLR4后受照的MCF-7細胞對存活分數(shù)降低，而刺激TLR4后受照的MCF-7細胞對存活分數(shù)升高，說明TLR4與MCF-7細胞的放射敏感性相關。這與Mittal等〔10〕報道的表達在輻射抵抗細胞上的TLR4對腫瘤的致癌作用必不可少結(jié)果相一致，結(jié)果說明高表達TLR4的腫瘤細胞比低表達的腫瘤細胞具有輻射抗性。

文獻報道〔13〕，電離輻射誘導的DNA 損傷可引起細胞周期延遲，受損細胞不能通過G1 期關卡和G2 期關卡而發(fā)生G1期阻滯及G2期阻滯，得到更多修復的機會，得以進入下一細胞周期，而未修復的細胞則被清除。本實驗結(jié)果顯示，輻射可誘導腫瘤細胞G2期阻滯，從而有充足的時間來修復DNA損傷，有利于細胞清除，這可能是不同腫瘤細胞有不同放射敏感性的原因之一，說明阻滯TLR4可以增敏乳腺癌MCF-7 細胞, 并且可以誘導細胞發(fā)生G2 期阻滯，其結(jié)果為臨床治療乳腺癌提供新的思考和實驗數(shù)據(jù), 為乳腺癌放射治療提供新的理論基礎。

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