SEA聯(lián)合熱療對Hela細胞周期進程及凋亡的影響

孟繁娟 劉賢英 祁盛昆

(長春市人民醫(yī)院，吉林 長春 130051)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率有逐漸年輕化趨勢〔1〕。目前，多采取放射治療、化療及生物治療為主的綜合治療。但是，熱療與生物治療聯(lián)合應用，近年來倍受關注，并取得了臨床治療效果〔2〕。本研究應用人宮頸癌細胞株(Hela)細胞為靶點，觀察葡萄球菌腸毒素A(SEA)聯(lián)合熱療對Hela細胞生物為行為影響，為人宮頸癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細胞及試劑 Hela細胞株由吉林省腫瘤研究所惠贈，四甲基偶氮唑藍(MTT)試劑、RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1MTT比色法 取對數(shù)生長期的Hela細胞調(diào)細胞數(shù)為2×105/ml，接種于96孔塑料培養(yǎng)板內(nèi)，100 μl/孔。當細胞生長達到80%匯合時進行分組，單純熱療組(43±0.2)℃持續(xù)加熱40 min，然后移入37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)；單純SEA組，根據(jù)預實驗結(jié)果SEA最適量為40 ng/ml；聯(lián)合組在單純SEA組基礎上再加熱(43±0.2)℃ 40 min，然后移入37℃ 5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，靜止培養(yǎng)24 h，于結(jié)束前6 h加入MTT試劑20 μl/孔，終濃度為500 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)6 h后，吸棄上清加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl/孔，震蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，于酶標儀570 nm處測量各孔吸光度A值，Hela細胞抑制率=(1-實驗組細胞A值÷對照組細胞值)×100%。對照組A組1.52±0.12，熱療組A值1.24±0.14，抑制率18.4%，SEA組A值1.12±0.16，抑制率26.4%，聯(lián)合組A組0.81±0.20，抑制率46.8%。

1.2.2流式細胞術(shù) 細胞培養(yǎng)及分組同1.2.1，不同之處是將96孔塑料培養(yǎng)板改為25 ml培養(yǎng)瓶進行，培養(yǎng)結(jié)束后細胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，70%冷乙醇固定，上機前過40目網(wǎng)，調(diào)細胞數(shù)為1×106/ml，碘化丙啶(PI)染色，流式細胞儀檢測，細胞周期結(jié)果以Modiff 2.0軟件分析，組間比較采用F檢驗。見表1。

1.2.3透射電子顯微鏡技術(shù) 細胞培養(yǎng)及分組同1.2.2收集不同條件下作用過的Hela細胞。移入椎形離心管內(nèi)，離心棄上清，應用2.5%戊二醛前固定，1%鋨酸后固定，遞度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，醋酸鉛-鈾雙重染色，透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié) 果

2.1MTT結(jié)果 不同條件下對Hela細胞增殖均有抑制作用，組間比較差異顯著，但聯(lián)合組效果顯著。

2.2流式細胞儀結(jié)果 不同條件下對Hela細胞增殖周期各時相均有影響。G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，組間比較差異顯著。見表1。

表1 不同條件下對Hela細胞周期進程影響及凋亡率(n=6)

2.3透射電子顯微鏡結(jié)果 不同條件下對Hela細胞超微結(jié)構(gòu)改變，細胞高度空化，線粒體腫脹，細胞核染色質(zhì)趨邊凝集，可見凋亡小體。

3 討 論

宮頸癌的主要生物學特點是腫瘤生長速度相對緩慢，以直接浸潤為主，很少向?qū)m體縱向浸潤〔3〕。宮頸癌向輸卵管及卵巢轉(zhuǎn)移不超過1%。根據(jù)宮頸癌上述生物學特點及臨床實踐驗證，宮頸癌更適合生物治療及物理治療。MTT實驗可準確反映活細胞數(shù)量及細胞活化狀態(tài)。因此被廣泛應用于抗腫瘤藥物篩選及細胞毒性的實驗研究，具有一定的客觀性。

文獻報道〔4〕，熱療可改變細胞周期兩個調(diào)控點，一個位于G1→S轉(zhuǎn)折點，控制細胞生長前期(G1期)進入DNA合成期(S期)，另一調(diào)控點位于G2→M期轉(zhuǎn)折點，是決定細胞一分為二的控制點。結(jié)果顯示，熱療可抑制G1期細胞向S期轉(zhuǎn)化進程，從而使G1期細胞增多，S期細胞減少，G2/M期細胞相對增多，G2/M期細胞增多是細胞損傷的普遍反映〔5〕。本研究應用SEA聯(lián)合熱療觀察其對Hela細胞的生物學改變，SEA是一組對熱穩(wěn)定的可溶性蛋白質(zhì)，能抵抗胃腸液中蛋白水解酶的水解作用。是食物中毒和毒素性休克的常見病因〔6〕。SEA殺傷腫瘤細胞有兩種途徑，直接的細胞毒效應和間接的殺傷腫瘤細胞，不需加工直接與MHC I類分子結(jié)合形成，通過配體抑制細胞增殖，由于SEA對熱穩(wěn)定，所以聯(lián)合熱療應用優(yōu)于化學藥物，因此具有廣闊應用前景。此外，本研究還應用透射電子顯微鏡觀察不同條件下對Hela細胞的超微結(jié)構(gòu)變化，可見細胞線粒體腫脹，有空泡形成，核染色質(zhì)趨邊凝集，可見凋亡小體。

綜上，SEA聯(lián)合熱療具有直接的細胞毒效應，尤其是宮頸癌屬于腔內(nèi)淺表腫瘤，可直接宮腔內(nèi)灌注殺傷腫瘤細胞，又便于直接排出體外，避免毒副作用的產(chǎn)生。因此，SEA聯(lián)合熱療用于婦科腫瘤的治療有廣闊前景。

4 參考文獻

1金 梅，章根琴，費小陽.早期子宮頸癌患者保留生育功能的經(jīng)腹根治性子宮頸切除術(shù)4例臨床分析〔J〕.實用腫瘤雜志，2012；7(4)：439-40.

2高 惠，楊耀琴.熱療與生物治療的聯(lián)合抗腫瘤效應〔J〕.國際腫瘤學雜志，2009；36(3)：193-5.

3王曉麗，趙衛(wèi)東.根治性宮頸切除術(shù)在浸潤性宮頸癌中的應用〔J〕.國際腫瘤學雜志，2013；40(7)：539-41.

4lim CU，Zhang Y，F(xiàn)ox MH，etal.Cell cycle dependent apoptosis and cell cycle blocks induced by hyperthermia in HL-60 cells〔J〕.Int J Hyperthermia，2006；22(1)：77-91.

5Thomas D，Chou S，Dauwalder O，etal.Diversity in Staphylococcus aureus enterotoxins〔J〕.Chem Immunol Allergy，2007；93(3)：24-41.

6Eillnger Ziegelbauer H，Karasuyama H，Yamada E，etal.Ste20-like kinase(SLK)，a regulatory kinase for polo-like kinase(PLK) during the G2/M transition in somatic cells〔J〕.Genes Cells，2005；5(6)：491-8.