燒傷病房老年患者感染銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類藥物現(xiàn)況

張若文 王 璐 姜焱碩 李 凡

(北華大學(xué)醫(yī)學(xué)部，吉林 吉林 132013)

銅綠假單胞菌是醫(yī)院獲得性感染最常見的條件致病菌之一。碳青霉烯類抗菌藥物在臨床抗銅綠假單胞菌感染治療中發(fā)揮了十分重要的作用，然而，銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗菌藥物臨床分離株逐漸增多，并在不同地區(qū)、國家播散，對臨床控制醫(yī)院感染造成了嚴重的危害。銅綠假單胞菌耐藥機制復(fù)雜，包括抗生素滅活酶或修飾酶的生成、外膜低滲透性、外膜孔蛋白缺失、生物膜形成和主動外排等〔1〕。產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶(MBL)又稱金屬酶，能水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，包括碳青霉烯類系列藥物，離子螯合物乙二胺四乙酸(EDTA)、菲咯啉以及巰基化合物抑制酶的活性部分，但不被MBL抑制劑如克拉維酸、舒巴坦等所抑制。產(chǎn)金屬酶是銅綠假單胞菌耐碳青霉烯類抗菌藥物最主要的耐藥機制，已成為目前銅綠假單胞菌耐藥機制研究中的熱點之一〔2〕。本研究擬探討燒傷病房銅綠假單胞菌多重耐藥性產(chǎn)生和爆發(fā)傳播的機制。

1 材料和方法

1.1菌株 2006年10～12月，從吉林市某醫(yī)院燒傷病房8名患者的患部膿汁和血液中分離出8株非發(fā)酵菌，所有菌株經(jīng)常規(guī)分離培養(yǎng)后，用Viteck系統(tǒng)鑒定確定為銅綠假單胞菌。

1.2試劑 Taq DNA聚合酶，PCR反應(yīng)緩沖液，dNTPs，瓊脂糖，EDTA，MH培養(yǎng)基。藥敏紙片：氨芐西林(AMP)、哌拉西林(PIP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、亞胺培南 (IMP)、氨曲南(AZT)、復(fù)方磺胺(SXT)、氯霉素(CHL)，購自O(shè)xoid公司。

1.3藥敏試驗

1.3.1Kirby-Bauer法 采用K-B法對常用的15種抗生素進行藥物敏感性監(jiān)測。標準質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。根據(jù)臨床實驗室標準研究所(CLSI，2006)判讀結(jié)果〔3〕。

1.3.2MIC值的測定 根據(jù)K-B法初選耐藥菌株，采用微量肉湯稀釋法進行六種藥物各15個濃度的體外藥物體外抑菌活性(MIC)值的測定。結(jié)果判斷依據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)制定的指南。

1.4MBLs菌株的確定 采用雙紙片增效法〔4〕。將受試菌均勻涂布于M-H瓊脂平板，然后在平板上貼兩張IMP(10 μg/片)紙片，其中1張紙片上加入適量EDTA，置35℃孵育16～18 h，比較兩張紙片的抑菌圈大小。加EDTA的IMP紙片比不加EDTA的IMP紙片抑菌圈明顯擴大，超過了5 mm判斷為產(chǎn)酶株。

1.5金屬酶基因和第1類整合子檢測

1.5.1細菌總DNA提取 根據(jù)文獻方法提取銅綠假單胞菌臨床分離株總DNA〔5〕。

1.5.2引物設(shè)計 下載NCBI數(shù)據(jù)庫金屬酶基因，采用DNAstar軟件設(shè)計四對引物，送上海生工合成，見表1。

表1 檢測金屬酶基因寡核苷酸引物

1.5.3PCR反應(yīng) 參考文獻方法進行〔6〕。

1.5.4PCR產(chǎn)物序列測定 提取PCR產(chǎn)物，用雙脫氧鏈末端終止法進行測序。

2 結(jié) 果

2.1K-B法藥敏實驗 8株銅綠假單胞菌對β-內(nèi)酰胺類藥物，氨芐西林、替卡西林、替卡西林/克拉維酸和頭孢唑啉，以及非β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物藥物，AMK、GEN、妥布霉素、SXT、四環(huán)素、CHI等15種抗菌藥物耐藥率均為100%。

2.2MIC檢測 銅綠假單胞菌對頭孢噻肟和頭孢吡肟(MIC>128 μg/ml)、IMP和AZT(MIC 32～8 μg/ml)表現(xiàn)高度耐藥。

2.3MBLs菌株的確定 采用雙紙片增效法檢測細菌產(chǎn)MBLs情況，結(jié)果顯示：加EDTA的IPM紙片比不加EDTA的IPM紙片抑菌圈明顯擴大，均超過了5 mm(≥20 mm)，說明雙紙片增效法試驗表型為陽性，證明8株銅綠假單胞菌臨床分離株均能產(chǎn)生MBLs。

2.4PCR和測序 以8株銅綠假單胞菌總DNA為模板，采用四種MBLs引物進行PCR擴增，只有VIM引物擴增出目標大小片段，VIM測序結(jié)果經(jīng)DNAstar程序進行拼接和校對后，登陸GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比較分析。比較結(jié)果發(fā)現(xiàn)與Pseudomonas aeruginosa(GenBank注冊號：JN819277.1)核苷酸序列同源性100%，說明銅綠假單胞菌攜帶VIM-2型MBLs基因。

3 討 論

碳青霉烯類抗菌藥物是一類廣譜高效的β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。其抗菌譜廣泛，抗菌活性強，對多數(shù)MBI(包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶和頭孢菌素酶(AmpC 酶)穩(wěn)定，與第三代頭孢菌素沒有交叉耐藥特性。臨床上主要包括帕尼培南、IMP、厄他培南、美羅培南等，是臨床上治療銅綠假單胞菌多重耐藥菌株感染的首選的抗菌藥物，已成為治療由革蘭陰性菌多藥耐藥菌株引起嚴重感染的最后防線。IMP曾經(jīng)是革蘭陰性菌耐藥率最低的，是治療銅綠假單胞菌首選藥物,但是隨著碳青霉烯類抗菌藥物的應(yīng)用增多，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性也有所增加，且耐碳青霉烯類抗菌藥物細菌大多數(shù)呈多重耐藥，甚至廣泛耐藥〔6〕。

金屬酶能水解大多數(shù)β-內(nèi)酰胺抗菌藥物，包括青霉素、頭霉素、頭孢菌素和碳青霉烯類(不包括氨曲南)，其中以IMP和VIM型金屬MBL最常見。VIM型金屬MBL最早發(fā)現(xiàn)于意大利，在意大利維羅納發(fā)現(xiàn)的VIM型金屬MBL被命名為VIM-1型〔7〕。截止到2011年底，共發(fā)現(xiàn)17型VIM金屬β-內(nèi)酰胺酶(VIM 1～17)。VIM-2型金屬MBL于2000年首次在法國首次報道〔8〕。實驗設(shè)計了IMP、VIM、SPM和GIM基因引物，采用PCR、克隆測序8株均攜帶VIM-2基因。

本實驗結(jié)果揭示了碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的銅綠假單胞菌在吉林地區(qū)燒傷病房流行，具有導(dǎo)致燒傷病房院內(nèi)感染爆發(fā)流行的危險性。碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的銅綠假單胞菌對頭孢菌素類、四環(huán)素類等多種抗菌藥物表現(xiàn)多重耐藥。銅綠假單胞菌攜帶VIM-2基因決定對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥。臨床醫(yī)療大量使用碳青霉烯類抗菌藥物加速銅綠假單胞菌借助可轉(zhuǎn)移傳遞因子的擴散，是燒傷病房銅綠假單胞菌爆發(fā)流行的主要原因〔9〕。

本實驗結(jié)果需要引起臨床醫(yī)生和臨床微生物工作者的密切關(guān)注，應(yīng)重視對多重耐藥銅綠假單胞菌產(chǎn)碳青霉烯酶的菌株同源性監(jiān)測，防止同一克隆株的播散〔10〕。要預(yù)防與控制燒傷病房的銅綠假單胞菌流行，應(yīng)加強以下工作：對于老年人和高危兒童氣管插管時要注意操作手法，要嚴格掌握各種侵入性診斷、治療指征，減少對氣道黏膜的損傷。要積極采取消毒隔離措施和無菌操作規(guī)范，嚴格遵守器械的消毒、滅菌規(guī)程。減少探視人員，保持環(huán)境干燥。重視洗手。事實上，預(yù)防醫(yī)院感染最關(guān)鍵、最經(jīng)濟、最有效的環(huán)節(jié)就是洗手，因此，在診療不同燒傷患者之間、進行各項操作前后等方面都要正確的洗手。此外，積極治療患者基礎(chǔ)性疾病，尤其是老年患者，減少燒傷患者住院日。掌握抗菌藥物合理使用原則，根據(jù)藥敏試驗結(jié)果選用藥物。要高度重視控制多重耐藥銅綠假單胞菌在醫(yī)院內(nèi)播散和院內(nèi)感染的暴發(fā)流行，一旦發(fā)現(xiàn)病房有流行趨勢要及時報告，以便積極采取控制措施〔11〕。

4 參考文獻

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11張鳳華，王婷葶，王大利.ICU病房銅綠假單胞菌的耐藥性及其產(chǎn)金屬β-內(nèi)酰胺酶的分析〔J〕.中國實驗診斷學(xué)，2010；14(11)：1762-3.