胃癌淋巴結的微轉移和胃癌生物學行為的關系

鄒勤光 所 劍 王大廣 何 亮

(吉林省腫瘤醫院胸外二科，吉林 長春 130012)

惡性腫瘤的轉移和復發是影響腫瘤病人預后的重要因素，胃癌的轉移方式主要是通過淋巴途徑，即使是早期胃癌，其淋巴轉移率也可達8%～15%〔1〕，而胃癌淋巴結的微轉移可能是導致淋巴結轉移主要原因。微轉移目前尚無統一的概念，一般是指非血液系統的惡性腫瘤在發展過程中，播散并存活于淋巴系統、血液系統、骨髓、肝、肺等組織器官中的微小腫瘤細胞灶，常無任何臨床表現〔2〕，普通病理檢查及常規診斷學檢查手段很難發現〔3〕。胃癌的生物學行為是指反映和表現胃癌性質或者惡性程度的指標。因此明確胃癌淋巴結微轉移和胃癌生物學行為之間的關系對胃癌病人的臨床治療有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1研究對象 研究組(胃癌淋巴結臨床轉移陰性組)選擇吉林大學第一醫院普通外科自2006年3～10月期間經病理診斷確定為胃癌，并行D3手術的患者共83例。取其胃周圍淋巴結共245枚，且這些淋巴結經常規病理檢查證實無臨床轉移。陰性對照組選取因胃潰瘍，胃間質瘤等其他胃部疾病而行胃大部切除術的病人8例，淋巴結共76枚。陽性對照組選取行D3手術的胃癌患者共31例，淋巴結141枚，并且這些淋巴結經普通病理檢驗證實有臨床轉移。

1.2標本選取 所有淋巴結均經過標記后，一半送病理科行常規檢查，另一半立即保存于-70℃低溫冰箱里保存待用。

1.3引物合成 選擇CK18引物及內參照基因引物(引物由大連寶生物公司提供),CK上游引物序列：5′ AAGAAAACCCGAAGAGG3′，下游引物：5′ TCTGACTCAAGGTGCAGC3′，擴增片段121 bp；β-actin引物序列：上游引物：5′ GTGGGGCGCCCCAGGCACCA3′，下游引物：5′ CTTCCTTAATGTCACGCACGATTTC3′，擴增片段500 bp。

1.4Trizol Reagent提取淋巴結總RNA(total RNA，tRNA) 按照Trizol Reagent說明提取淋巴結的總RNA，-70℃保存。提取方法如下：取淋巴結組織約100 mg，置于研磨器中，加入1 ml Trizol Reagent，勻漿。裂解液放入1ml DEPC水泡過并高壓后的Ep管中。室溫孵育5 min，使核蛋白復合物充分裂解。每管加200 μl氯仿，蓋上管蓋，劇烈翻轉15 s，室溫靜置3 min。4℃離心15 min。將上層水相轉移到一新的1 ml DEPC水泡過并高壓后的EP管中，加入500 μl異丙醇，室溫靜置10 min。4℃離心10 min。離心后，在試管底部可見白色膠狀沉淀。棄上清，在離心管中加入1 ml 75%的乙醇洗滌RNA沉淀。用混懸器混合離心管，4℃離心5 min。棄上清，空氣中干燥RNA，然后加入50 μl高壓后的DEPC水。取10 μl用紫外分光光度計測OD值，再取4.5 μl進行甲醛變性的瓊脂糖凝膠電泳。

2.2CK18 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 研究組微轉移陽性患者同無淋巴結微轉移的胃癌患者相比，其腫瘤組織分化明顯更差；腫瘤侵犯的深度更深；同時浸潤性生長所占的比率大；Borrmann分型中Ⅲ、Ⅳ型腫瘤所占的比率更大(P<0.05)。而對二者進行腫瘤的部位，年齡、性別等因素進行比較，結果無明顯差異(P>0.05)。見表1。

①飲食清淡,忌辛辣次驚性食物,多食新鮮蔬菜。水果。②注意點眼衛生:點眼錢用肥皂洗凈雙手,仰臥位,辦開下眼瞼,藥品口距結膜囊1-2CM,向結膜囊內滴入1-2滴眼液,連續點兩種或以上眼藥時,需要間隔3-5分鐘,禁止將眼藥點健眼,或者讓家人使用,尤其含激素的眼藥不能隨意點,按醫生要求執行和停用。每日正常洗臉,注意用眼衛生,單獨使用一張毛巾,每周用開水煮沸消毒一次,勿揉眼睛,勿讓臟物或臟水進入眼內。③活動與休息:避免過度用眼,禁止劇烈運動,如:跳、跑、抬、舉④部分患者涉及戴鏡或弱視訓練,請復查時嚴格遵醫師指使執行。⑤按照醫師指定的時間內復查。

1.7統計學方法 采用統計軟件SPSS14.0處理。結果百分率用χ2檢驗。

全詩描寫了溫馨的場景：華堂綺窗，佳人對月弦歌，友人酬唱，貴族宴樂，詩人被歌聲和美酒所陶醉，意氣相投，一擲千金而不惜，尾句正是全詩寓意所在。

2 結 果

微轉移的檢測方法有多種。連續切片是最早用于檢測淋巴結微轉移的一種粗略方法。近年來已很少使用。細胞培養方法敏感性更高些。欠缺的是條件要求嚴格，影響環節多。免疫組化、免疫熒光和放射免疫檢測具有重要應用價值，但單抗的質量、交叉反應、機體產生自身抗體等因素影響其敏感性、特異性〔8〕。轉基因法〔9〕技術條件要求高，只能用于實驗研究階段，尚不適用于臨床研究。多參數的流式細胞儀已成功應用于微轉移腫瘤細胞的識別，但因其方法復雜、價格昂貴，臨床上很難推廣〔10〕。

1.6數據處理分析 應用Glyko bandscan分析系統分別測定樣本每個淋巴結CK18 mRNA及β-actin陽性條帶的總灰度，測量2次取平均值。并計算每個淋巴結CK18 mRNA/β-actin的值。以CK18 mRNA/β-actin的值≥1.5為CK18 mRNA高度表達，以CK18 mRNA/β-actin的值<1.5為低度表達或者不表達，分別檢驗研究組、胃癌淋巴結臨床轉移陽性組及其他胃部疾病組患者淋巴結CK18 mRNA表達情況。再對研究組患者中反映腫瘤生物學行為的因素如腫瘤大體分型、組織學類型、腫瘤侵犯深度、腫瘤部位等的情況同其淋巴結微轉移的情況相聯系進行比較。

基因檢測具有高度敏感性、特異性，可準確檢測1 mg組織或1 ml液體中的1個癌細胞，被認為是目前檢測微轉移的最有效方法。可檢測的標志物種類眾多，如可以檢測異?；騪53〔11〕、ras、ApC、DCC、CD44〔12〕、erb-B2等。

1.5甲醛變性的瓊脂糖凝膠RNA電泳 用35 ml蒸餾水融化0.7 g瓊脂糖，冷卻至60℃左右加入10 ml甲醛和11 ml 5×緩沖液(0.1 mmol/L MOPS PH7.0，40 mmol/L乙酸鈉，50 mmol/L EDTA)混勻，灌制凝膠，將凝膠浸于1×甲醛電泳緩沖液中準備電泳，每孔上樣20 μl(4.5 μl RNA，2.0 μl 5×緩沖液，3.5 μl甲醛，1.0 μl甲酰胺)，上樣前樣品于65℃加熱15 min，冰水中冷卻，離心后加2.0 μl 10×上樣緩沖液(50%甘油，1.0 mmol/L EDTA，0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF)，混勻后上樣，在100 V電壓下電泳0.5 h，用溴化乙錠染色30 min，紫外分析儀下拍照記錄。紫外分光光度計測定tRNA濃度：取10 μl tRNA溶液，加入990 μl高壓后的DEPC處理水，在260 nm紫外波長下測定tRNA的OD值，計算tRNA含量。RT-PCR擴增：逆轉錄體系為取25 μl樣本RNA，加oligo dT 3 μl，DEPC水2 μl，70℃孵育5 min，冰浴5 min，加5×Buffer 10 μl，dNTP 4 μl，RNAsin 1 μl，AMV 1 μl，DEPC水4 μl。擴增采用Gene Amp PCR System 2400型PCR擴增儀進行PCR擴增，按如下條件進行循環：94℃預變性5 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個循環，終末72℃延伸10 min。產物用1%瓊脂糖電泳，紫外透射儀下觀察并照相記錄結果。

*本文為2013年度中央文獻對外翻譯與傳播協同創新中心項目“中央軍事文獻對外傳播流程研究”（編號：2013XT10）的階段性成果。

圖1 研究組患者CK18 mRNA電泳圖

表1研究組微轉移陰、陽性患者CK18mRNA陽性表達與患者臨床病理特征的關系〔n(%)〕

臨床病理特征研究組微轉移陽性(n=51)微轉移陰性(n=32)P值浸潤生長39(76.5)8(25.0) <0.05分化差者43(84.3)13(40.6) <0.05漿肌層及漿肌層以外受侵犯44(86.2)11(34.4) <0.05BorrmannⅢ及Ⅳ型患者比例47(92.1)12(37.5) <0.05腫瘤部位胃上部4(7.8)4(12.5) >0.05胃體部7(13.7)6(18.7) >0.05胃竇部20(39.2)22(68.8) >0.05患者平均年齡(歲)6763 >0.05性別男22(43.1)21(65.6) >0.05女9(17.6)11(34.4) >0.05

3 討 論

胃癌淋巴結的轉移狀況是影響預后的一個重要因素〔1〕，并且淋巴結轉移、漿膜受侵是胃癌術后各種復發包括術后早期(術后24個月以內)復發的危險因素〔2〕。還有些學者〔3〕認為淋巴結臨床轉移陰性的胃癌其臨床病理生物學特性與早期胃癌相似，手術后預后較好，而有淋巴結轉移的胃癌預后則較差。對胃癌病人行系統性淋巴結清掃術能明顯改善其預后情況，延長生命，并且不增加手術并發癥，術后5年生存率可達50%以上〔4，5〕。良好的手術效果可能與早期診斷(可使臨床病理分期提前)及廣泛徹底的淋巴清掃有關。Bosing等〔5〕報道胃癌患者行根治性術后總體5年生存率達49%，且胃癌病人無淋巴結轉移(pTx pN0)或轉移局限于胃周淋巴結(pTx pN1)者行系統性淋巴結清掃術后生存率明顯增加。但也有學者報道認為廣泛淋巴清掃不能改善胃癌病人的預后，且增加手術并發癥〔6〕。

微轉移是腫瘤轉移、復發的基礎和前提，因此對于微轉移灶的檢測有利于判斷患者臨床分期及預后以及指導治療〔7〕。也正是因為這個原因廣大學者在積極開展對微轉移的檢測方法的研究。本實驗就是應用近幾年廣泛開展的半定量RT-PCR技術以CK18為標記檢測胃癌淋巴結的微轉移情況，并把檢測結果與胃癌的腫瘤生物學特點進行比較分析以明確二者聯系。

2.1CK18 mRNA表達 研究組共有83例患者245枚淋巴結，其中51例(61.4%)患者的125枚(51.1%)淋巴結CK18 mRNA高度表達即這些淋巴結微轉移陽性。陰性對照組患者8例淋巴結76枚CK18 mRNA全部無表達；陽性對照組患者31例，淋巴結141枚CK18 mRNA全部高表達。見圖1。

黨的十八大以來，在應對“把綠水青山轉化為金山銀山”的問題上，江西因勢而定、乘勢而上，堅持把發展綠色產業、促進產業綠色化，作為促進經濟發展與資源環境相協調的基本途徑。

目前以CK家族為標志物利用RT-PCR來檢測胃癌淋巴結是極為常用和非常有效的方法，當然，現階段RT-PCR檢測腫瘤微轉移尚存在一定局限性。包括缺乏腫瘤特異性靶RNA、靶RNA的非特異性表達、假陽性和假陰性問題的困擾。但是隨著新的腫瘤特異性靶RNA的發現、PCR反應條件的優化以及定量PCR技術的不斷成熟〔13〕，涉及腫瘤細胞的微轉移灶的診斷將更為敏感、特異和可靠，相信RT-PCR方法將會成為檢測臨床腫瘤微轉移的常規方法。

長期以來世界各地學者關于進展期胃癌的手術中淋巴結清掃范圍意見不統一〔14，15〕。本研究結果認為胃癌淋巴結存在較高的微轉移。而且普通病理難以發現的這些淋巴結微轉移，同時我們發現胃癌淋巴結的微轉移同癌灶浸潤深度、腫瘤的大體類型、組織學分型等生物學行為特點密切相關。可以明確遠站淋巴結微轉移陽性的患者其腫瘤生物學行為明顯更趨向惡性特點。另一方面僅有微轉移的淋巴結大多數僅有輕微腫大，容易造成術中被外科醫生忽視，導致清掃不徹底，而影響患者預后。因此我們認為，胃癌的根治性手術中應常規對胃癌各站淋巴結進行清掃以降低術后腫瘤復發的概率。另一方面我們也主張在術后應該對這些遠站淋巴結進行微轉移的檢測并根據結果指導術后的治療及判斷腫瘤的臨床分期。當然這個結論還有待于對這些患者的預后進行跟蹤隨訪而進一步明確。

不過哥哥講故事的時候，翠姨總比我們留心聽些，那是因為她的年齡稍稍比我們大些，當然在理解力上，比我們更接近一些哥哥的了。哥哥對翠姨比對我們稍稍的客氣一點。他和翠姨說話的時候，總是“是的”“是的”的，而和我們說話則“對啦”“對啦”。這顯然因為翠姨是客人的關系，而且在名分上比他大。

胃癌的合理分期對于指導選擇綜合治療方案，判斷療效及預后具有重要的意義。本實驗結果表明研究組中所有患者按照傳統的TNM分期均應該為N0 期，然而對照組中胃癌淋巴結微轉移陽性的病人其各項腫瘤生物學行為特點與淋巴結微轉移陰性的病人相比均又顯著差異，胃癌淋巴結微轉移陽性的病人其腫瘤生物學行為特點惡性程度更高。因此是淋巴結微轉移情況對胃癌患者進行臨床分期的劃分和預后的判斷的不可忽視的重要因素，應該成為TNM分期的一項重要參考指標。但是由于胃癌淋巴結的微轉移由于檢測起來相對要求更高的實驗室技術及實驗人員技術，并需要一定時間，而且現在沒有為廣大學者公認的檢測胃癌淋巴結微轉移的簡單，可靠，而且有效的方法。因此對胃癌淋巴結的微轉移的檢測在臨床上的應用價值還有待探討，其具體意義有待進一步探索和闡述。

總之，通過本實驗可以看出胃癌淋巴結的微轉移與胃癌的各種生物學行為特點密切相關，其微轉移的情況因該作為臨床中指導胃癌的臨床分期及治療方法的一個重要參考條件，但是由于本實驗時間有限制，缺乏對患者5年生存率的直觀觀察因此對于胃癌淋巴結尤其是遠站淋巴結微轉移陽性與患者預后情況還有待進一步的研究。

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