高爾基體應激與抗氧化系統在缺血腦損傷中的作用

2014-09-12 03:24:50周文勝洪秀琴

中國老年學雜志 2014年1期

王佳周文勝洪秀琴

(湖南省老年醫院湖南省老年醫學研究所神經疾病研究室，湖南長沙 410016)

高爾基體(GA)應激是GA對氧化應激所做出的應答，而氧化應激是導致缺血性腦損傷的主要機制之一，GA常常涉及到氧化應激所介導的神經疾病的發病機制之中，抗氧化系統對缺血性腦損傷具有神經保護作用。本文就GA應激與過氧化物歧化酶、谷氧還蛋白系統和硫氧還蛋白系統等主要抗氧化系統在缺血性腦損傷的作用作一綜述。

1 GA在細胞活動中起重要作用

GA作為一個細胞器，因其在生物合成、脂類及蛋白質的分類和轉運上起了十分重要的作用，引起了許多科學家的關注。值得關注的是，GA是神經鞘脂類生物合成的主要場所〔1〕，也作為蛋白和脂類翻譯后修飾的“工廠”(多數情況是經過糖基化修飾)。許多因素包括在病理條件下，在藥物制劑的影響下，以及一些高爾基相關蛋白的過表達，都可以導致GA的形態發生改變，從而影響GA的功能。因此，一旦神經元的GA功能受損，會導致蛋白結構異常，蛋白及脂質轉運異常，神經元生理功能紊亂而引起疾病的發生。

2 氧化應激是導致缺血性腦損傷的主要機制之一

研究發現腦缺血再灌注后，各種損傷機制可引起包括線粒體和GA等多個亞細胞器超微結構的形態及功能發生變化，并且出現一系列的亞細胞應激反應〔2〕，這可作為判斷神經細胞受損與否以及損傷程度的重要標志。許多研究表明，氧化應激是導致缺血性腦損傷的主要機制之一。活性氧(ROS)在一些神經系統疾病〔如腦缺血、腦卒中和阿爾茨海默病(AD)〕的病理生理過程中起了十分重要的作用〔3～5〕。由缺血導致神經元損傷的一個主要機制是細胞內不斷增加的ROS介導DNA、蛋白質和其他大分子的氧化損傷，從而導致神經元的凋亡，最終誘發神經退行性疾病〔6〕。就組織病理變化而言，可表現為 DNA 分子中單股或雙股的核苷酸鏈斷裂、DNA蛋白質交聯、堿基結構改變等，從而導致基因變異或突變；對脂質中主要分布于細胞膜結構的多不飽和脂肪酸的損傷則可生成過多的過氧化脂質及降解產物，從而導致動脈粥樣硬化的逐步形成和心腦血管疾病的發生；對蛋白質中的一些重要氨基酸中的肽鍵和二硫鍵的損傷則為肽鍵的斷裂或二硫鍵結構改變而致蛋白酶及抗氧化物酶活力減弱甚至喪失其功能等。

3 缺血性腦損傷與GA應激

當氧化應激發生時，細胞積極抵抗氧化損傷和恢復氧化還原平衡。所有的器官都在對氧化應激做出適應性的應答，例如激活核內編碼防御酶、轉錄因子以及結構蛋白相關的基因〔7〕。可想而知，在氧化應激的情況下，本來結構穩定且有著正常生理功能的GA也會由此受到影響〔8〕。GA的這些改變可能觸發和傳遞下游應激信號導致細胞的適應，或者，如果氧化應激太嚴重，GA碎裂甚至出現細胞凋亡。越來越多的證據也表明，GA涉及氧化應激所介導的神經疾病的發病機理之中，如在肌萎縮側索硬化(ALS)、帕金森病(PD)、腦缺血和AD等疾病中就發現了GA碎裂的現象，并且可隨時間延長而加重〔9～12〕。在新生的缺血再灌注動物模型中〔13〕，GA在缺血再灌注的早期就發現在紋狀體神經元發生碎裂的現象。在全腦缺血再灌注大鼠中〔14〕，GA碎裂成池狀小泡和不規則的膜螺紋。GA的碎裂可能對其分泌活性產生不利影響，并且由此改變神經元的活性。GA碎裂其中的一個關鍵機制是與氧化應激密切相關。氧化應激主要是通過以下三個途徑介導GA的碎裂〔15〕：①氧化應激導致GA微管蛋白的損傷；②氧化應激激活清除GA結構蛋白的凋亡蛋白酶；③氧化應激誘導Ca2+的異常從而導致內質網的應激，內質網應激導致GA的碎裂。

Jiang等〔15〕把GA對氧化應激所做出的應答稱之為GA應激。GA應激代表了GA容易對細胞內的生理失衡產生相應應答的能力，如GA出現形態的改變或最終的碎裂。高爾基的Ca2+/Mn2+ATP酶和其他定位在高爾基中的活性蛋白可能積極參與GA應激過程，最終出現GA的碎裂與神經細胞的凋亡。

4 GA應激與抗氧化系統在缺血性腦損傷中的研究進展

4.1GA與線粒體即往研究發現，線粒體的功能紊亂在一些神經系統疾病的發病機理中起了十分關鍵作用。事實上，在一些凋亡過程中，研究人員發現線粒體也承受著碎裂的情況〔20〕。線粒體蛋白Mfn1是維護線粒體融合所必需的蛋白，在氧化應激下過表達Mfn1能有效地阻止線粒體的碎裂和神經細胞的死亡〔21〕。Nakagomi等〔22〕在經氧化應激處理的皮質神經元中過表達Mfn1，發現不僅能明顯抑制線粒的碎裂，而且能一定程度減少GA碎裂的情況。說明線粒體處于GA碎裂信號通路的上游，也對GA的碎裂起到了重要的作用。

4.2GA與SODs SODs是細胞內抗氧化所必需的一種酶，許多研究表明SODs在腦缺血后有明顯的神經保護作用〔23，24〕。Fujimura等〔23〕報道稱，小鼠在腦缺血后，SOD1可以避免DNA損傷修復酶過早的減少。另外，Kim等〔24〕也稱在由血栓造成的SOD1轉基因小鼠缺血后，表達增加的SOD1能減少DNA的氧化損傷和細胞死亡中DNA的碎裂。同樣，在正常的生理情況下，SOD2缺陷型的突變小鼠會出現過氧化物離子顯著的增加，而這種情況一般只在野生型小鼠腦缺血時才會發生〔25〕。進一步研究發現，機體通過對SOD2活性的調節產生神經保護作用，以減少腦缺血所帶來的損傷〔26～28〕。

另有研究表明，SOD1的突變形式在神經系統疾病如肌萎縮側索硬化癥(fALS)和類似fALS的運動神經元病的發病機制中起了重要的作用〔29，30〕。在fALS中，氧化應激在突變的SOD1的毒性方面起了十分重要的作用。fALS的一個主要是特征是在其早期會出現GA碎裂的現象〔31，32〕。除了其超氧化物歧化活性，SOD1也有自由基生成活性，產生的自由基主要是通過利用H2O2和其他小分子陰離子作為底物。研究表明〔33，34〕，在SOD1G93A 突變的fALS轉基因小鼠中自由基生成活性相比野生型的要高出許多。因此，在fALS中，有可能突變的SOD1蛋白，以及隨后發生的較低的ROS清除率和較高的ROS生成率都會導致GA的碎裂，然而，這些結果與fALS中超氧物介導的氧化損傷的病理機制不一致。

4.3GA與谷氧還蛋白系統(GRX) 谷氧還蛋白(Grx)是細胞內一種重要的巰基-二硫鍵氧化還原酶，具有多種生物學功能，在細胞內氧化還原平衡狀態的調控及抵抗氧化應激損傷過程中發揮重要作用。正常生理情況下，Grx可與胞質內谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽還原酶(GR)、NADPH共同構成一個氧化還原調節系統，還原體內被氧化了的蛋白質，且對蛋白谷胱甘肽混合型二硫化物的還原具有高選擇性。Grx利用谷胱甘肽的兩個或一個半胱氨酸殘基既可以催化蛋白質之間形成的二硫鍵還原，也可以催化蛋白質巰基與小分子巰基化合物之間形成的混合二硫鍵的還原，最常見的就是蛋白質與GSH 之間形成的混合二硫鍵(Pr-S-S-G)。Fernandes等〔35〕研究發現，在各種氧化應激損傷過程中，谷胱甘肽化蛋白質(Pr-S-S-G)結構最先形成，而Grx的作用主要是對巰基-蛋白質(SH-protein)早期氧化損傷形成的Pr-S-S-G進行修復。因此，在體內的抗氧化防御體系中，Grx發揮著關鍵作用。Takagi等〔36〕研究發現，當鼠腦中動脈缺血4 h后，腦組織中Grx mRNA 和蛋白的表達均下降，而這種下降和神經元損傷呈平行關系。因此，腦組織中Grx含量的維持，對于神經元抵御氧化應激或GA應激作用非常重要。如果在腦缺血再灌注損傷后的腦組織中迅速給予Grx，可能減弱GA應激或減輕腦組織的損傷。

到目前為止，在哺乳類動物中已經發現4個Grx亞類〔37〕。定位于細胞質的Grx1；主要定位于線粒體的Grx2(Grx2a，睪丸細胞與一些癌細胞表達該蛋白兩個額外的細胞質/細胞核亞型，Grx2b和Grx2c來源于可供選擇的轉錄起始和剪切)；定位于細胞質的多區域單硫基Grx3；以及線粒體單硫基。

而據Mesecke等〔38〕報道，Grx家族(Grxs)逐漸擴大，新的Grxs成員不斷被發現，諸如：Grx6、Grx7和Grx8。Grx6和Grx7能阻止底物蛋白特定硫基的氧化，并且在細胞抵抗氧化應激方面起著關鍵性的作用。Grx6和Grx7都定位于順面GA，并且是目前發現的第一個位于分泌途徑中內質網下游的氧化還原組分。Grx6和Grx7定位于GA，可以認為它們的合成及其轉運通過了GA，并且這對說它們的分泌是必需的。Grx6和Grx7作為抗氧化蛋白，可能對氧化應激下的高爾基體產生保護作用，但這種保護作用是直接對GA的功能產生影響，還是能減少損傷高爾基膜的一些毒性細胞分子，從而達到盡可能維持高爾基膜的完整性，具體機制是值得深入研究的。

4.4GA與硫氧還蛋白系統(TRX) 硫氧還蛋白(Trx)是一類分布廣泛的小分子多功能蛋白，它們在進化上相當保守，一般都具有一個相同的有氧化還原活性的Cys-Gly-Pro-Cys的氨基酸序列。Trx與硫氧還蛋白還原酶(TrxR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸( NADPH )三者共同組成硫氧還蛋白系統。其主要作用是通過二硫鍵-巰基的交換反應維持細胞內外氧化還原平衡及在氧化應激反應中抗氧化和清除自由基。目前在硫氧還蛋白家族(Trxs)中，主要有Trx1和Trx2兩型，Trx1位于細胞質和細胞核中，而Trx2 僅位于線粒體中，被認為是Trx家族中的一種線粒體特異性蛋白。Trx1和Trx2都不依賴經典的ER-Golgi途徑就能分泌到細胞外發揮功能。但Jimenez等〔39〕人報道了一個新的Trx蛋白Trx3，該蛋白只在精子細胞中表達，并且是迄今發現的第一個特定的定位于GA的硫氧還蛋白。Trx3為生殖細胞的分化提供了合適的氧化還原環境，并且在高爾基中它的功能可能與精子細胞特定功能蛋白的翻譯后修飾有關。

Trx有強烈的清除體內過氧化物的功能，能保護細胞免受諸如腫瘤壞死因子(TNF)以及H2O2等的損傷。在缺血再灌注轉基因大鼠中，通過AKT信號的介導，Trx的過表達可阻止神經細胞的凋亡〔40〕。在體內局部的腦缺血再灌注可誘導Trx短暫的表達〔41〕。這些研究結果均表明：Trx能生理性地保護細胞抵御氧化應激及其相關的外界環境改變〔42〕。神經退行性病變患者腦中Trx 水平普遍下降，特別是在杏仁核和海馬區域，同時發現了高爾基體碎裂的現象〔43〕。范義等〔44〕通過應用Trx對腦組織缺血再灌注損傷治療，結果顯示：Trx能減小腦缺血再灌注后腦梗死面積，降低腦組織勻漿中MDA含量及提高SOD活性。但是，Trx發揮其神經保護作用是否通過了GA，或者對GA產生了怎樣的作用，這些都是值得研究和探討的。

5 小結

綜上所述，在缺血性腦損傷中，抗氧化系統可能可以通過減弱氧化應激來推遲或減少GA碎裂的情況，最終達到推遲和延長神經細胞死亡的機制。因此，通過改變抗氧化系統相關蛋白表達水平，降低氧化敏感性，維持GA正常生理功能，可以為由氧化應激損傷導致的各種神經系統疾病的治療提供一種新策略。

6 參考文獻

1Holthuis JC，Pomorski T，Raggers RJ,etal.The organizing potential of sphingolipids in intracellular membrane transport〔J〕.Physiol Rev，2001；81(4)：1689-723.

2Truettner JS，Hu K，Liu CL,etal.Subcellular stress response and induction of molecular chaperones and folding proteins after transient global ischemia in rats〔J〕.Brain Res，2009；(11)：1249：9-18.

3Floyd RA.Antioxidants，oxidative stress，and degenerative neurological disorders〔J〕.Proc Soc Exp Biol Med，1999；222(3)：236-45.

4Ren J，Fan C，Chen N,etal.Resveratrol pretreatment attenuates cerebral ischemic injury by upregulating expression of transcription factor Nrf2 and HO-1 in rats〔J〕.Neurochem Res，2011；36(12)：2352-62.

5Sugawara T，Chan PH.Reactive oxygen radicals and pathogenesis of neuronal death after cerebral ischemia〔J〕.Antioxid Redox Signal，2003；5(5)：597-607.

6Numagami Y，Sato S，Ohnishi ST.Attenuation of rat ischemic brain damage by aged garlic extracts：a possible protecting mechanism as antioxidants〔J〕.Neurochem Int，1996；29(2)：135-43.

7Mahon KP，Potocky TB，Blair D,etal.Deconvolution of the cellular oxidative stress response with organelle-specific Peptide conjugates〔J〕.Chem Biol，2007；14(8)：923-30.

8Hicks SW，Machamer CE.Golgi structure in stress sensing and apoptosis〔J〕.Biochim Biophys Acta，2005；1744(3)：406-14.

9Stieber A，Chen Y，Wei S,etal.The fragmented neuronal Golgi apparatus in amyotrophic lateral sclerosis includes the trans-Golgi-network：functional implications〔J〕.Acta Neuropathol，1998；95(3)：245-53.

10Fujita Y，Ohama E，Takatama M,etal.Fragmentation of Golgi apparatus of nigral neurons with alpha-synuclein-positive inclusions in patients with Parkinson′s disease〔J〕.Acta Neuropathol，2006；112(3)：261-5.

11Baloyannis SJ，Costa V，Michmizos D.Mitochondrial alterations in Alzheimer′s disease〔J〕.Am J Alzheimers Dis Other Demen，2004；19(2)：89-93.

12Hu Z，Zeng L，Xie L,etal.Morphological alteration of Golgi apparatus and subcellular compartmentalization of TGF-beta1 in Golgi apparatus in gerbils following transient forebrain ischemia〔J〕.Neurochem Res，2007;32(11)：1927-31.

13Martin LJ，Brambrink AM，Price AC,etal.Neuronal death in newborn striatum after hypoxia-ischemia is necrosis and evolves with oxidative stress〔J〕.Neurobiol Dis，2000；7(3)：169-91.

14Rafols JA，Daya AM，O′Neil BJ,etal.Global brain ischemia and reperfusion：Golgi apparatus ultrastructure in neurons selectively vulnerable to death〔J〕.Acta Neuropathol，1995；90(1)：17-30.

15Jiang Z，Hu Z，Zeng L,etal.The role of the Golgi apparatus in oxidative stress：is this organelle less significant than mitochondria〔J〕?Free Radic Biol Med，2011；50(8)：907-17.

16Ahn JH，Choi JH，Song JM,etal.Increase in Trx2/Prx3 redox system immunoreactivity in the spinal cord and hippocampus of aged dogs〔J〕.Exp Gerontol，2011；46(11)：946-52.

17Drechsel DA，Patel M.Respiration-dependent H2O2removal in brain mitochondria via the thioredoxin/peroxiredoxin system〔J〕.J Biol Chem，2010；285(36)：27850-8.

18Zhang H，Go YM，Jones DP.Mitochondrial thioredoxin-2/peroxiredoxin-3 system functions in parallel with mitochondrial GSH system in protection against oxidative stress〔J〕.Arch Biochem Biophys，2007；465(1)：119-26.

19Delanty N，Dichter MA.Antioxidant therapy in neurologic disease〔J〕.Arch Neurol，2000；57(9)：1265-70.

20Youle RJ，Karbowski M.Mitochondrial fission in apoptosis〔J〕.Nat Rev Mol Cell Biol，2005；6(8)：657-63.

21Bossy-Wetzel E，Barsoum MJ，Godzik A,etal.Mitochondrial fission in apoptosis，neurodegeneration and aging〔J〕.Curr Opin Cell Biol，2003；15(6)：706-16.

22Nakagomi S，Barsoum MJ，Bossy-Wetzel E,etal.A Golgi fragmentation pathway in neurodegeneration〔J〕.Neurobiol Dis，2008；29(2)：221-31.

23Fujimura M，Morita-Fujimura Y，Kawase M,etal.Manganese superoxide dismutase mediates the early release of mitochondrial cytochrome C and subsequent DNA fragmentation after permanent focal cerebral ischemia in mice〔J〕.J Neurosci，1999；19(9)：3414-22.

24Kim GW，Lewen A，Copin J,etal.The cytosolic antioxidant，copper/zinc superoxide dismutase，attenuates blood-brain barrier disruption and oxidative cellular injury after photothrombotic cortical ischemia in mice〔J〕.Neuroscience，2001；105(4)：1007-18.

25Murakami K，Kondo T，Kawase M,etal.Mitochondrial susceptibility to oxidative stress exacerbates cerebral infarction that follows permanent focal cerebral ischemia in mutant mice with manganese superoxide dismutase deficiency〔J〕.J Neurosci，1998；18(1)：205-13.

26Nemethova M，Danielisova V，Gottlieb M,etal.Post-conditioning exacerbates the MnSOD immune-reactivity after experimental cerebral global ischemia and reperfusion in the rat brain hippocampus〔J〕.Cell Biol Int，2008；32(1)：128-35.

27Jung JE，Kim GS，Narasimhan P,etal.Regulation of Mn-superoxide dismutase activity and neuroprotection by STAT3 in mice after cerebral ischemia〔J〕.J Neurosci，2009；29(21)：7003-14.

28Yan BC，Choi JH，Yoo KY,etal.Leptin′s neuroprotective action in experimental transient ischemic damage of the gerbil hippocampus is linked to altered leptin receptor immunoreactivity〔J〕.J Neurol Sci，2011；303(1-2)：100-8.

29Rosen DR.Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Nature，1993；364(6435)：362.

30Gurney ME，Pu H，Chiu AY,etal.Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation〔J〕.Science，1994；264(5166)：1772-5.

31Tu PH，Gurney ME，Julien JP,etal.Oxidative stress，mutant SOD1，and neurofilament pathology in transgenic mouse models of human motor neuron disease〔J〕.Lab Invest，1997；76(4)：441-56.

32Beal MF，Ferrante RJ，Browne SE,etal.Increased 3-nitrotyrosine in both sporadic and familial amyotrophic lateral sclerosis〔J〕.Ann Neurol，1997；42(4)：644-54.

33Yim MB，Kang JH，Yim HS,etal.A gain-of-function of an amyotrophic lateral sclerosis-associated Cu,Zn-superoxide dismutase mutant：An enhancement of free radical formation due to a decrease in Km for hydrogen peroxide〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A，1996；93(12)：5709-14.

34Yim HS，Kang JH，Chock PB,etal.A familial amyotrophic lateral sclerosis-associated A4V Cu，Zn-superoxide dismutase mutant has a lower Km for hydrogen peroxide.Correlation between clinical severity and the Km value〔J〕.J Biol Chem，1997；272(14)：8861-3.

35Fernandes AP，Fladvad M，Berndt C,etal.A novel monothiol glutaredoxin (Grx4) from Escherichia coli can serve as a substrate for thioredoxin reductase〔J〕.J Biol Chem，2005；280(26)：24544-52.

36Takagi Y，Nakamura T，Nishiyama A,etal.Localization of glutaredoxin (thioltransferase) in the rat brain and possible functional implications during focal ischemia〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，1999；258(2)：390-4.

37Lillig CH，Berndt C，Holmgren A.Glutaredoxin systems〔J〕.Biochim Biophys Acta，2008；1780(11)：1304-17.

38Mesecke N，Spang A，Deponte M,etal.A novel group of glutaredoxins in the cis-Golgi critical for oxidative stress resistance〔J〕.Mol Biol Cell，2008；19(6)：2673-80.

39Jimenez A，Zu W，Rawe VY,etal.Spermatocyte/spermatid-specific thioredoxin-3，a novel Golgi apparatus-associated thioredoxin，is a specific marker of aberrant spermatogenesis〔J〕.J Biol Chem，2004；279(33)：34971-82.

40Zhou F，Gomi M，Fujimoto M,etal.Attenuation of neuronal degeneration in thioredoxin-1 overexpressing mice after mild focal ischemia〔J〕.Brain Res，2009；1272：62-70.

41Yan BC，Park JH，Ahn JH,etal.Comparison of the immunoreactivity of Trx2/Prx3 redox system in the hippocampal CA1 region between the young and adult gerbil induced by transient cerebral ischemia〔J〕.Neurochem Res，2012；37(5)：1019-30.

42Kim YC，Masutani H，Yamaguchi Y,etal.Hemin-induced activation of the thioredoxin gene by Nrf2.A differential regulation of the antioxidant responsive element by a switch of its binding factors〔J〕.J Biol Chem，2001；276(21)：18399-406.

43Lovell MA，Xie C，Gabbita SP,etal.Decreased thioredoxin and increased thioredoxin reductase levels in Alzheimer′s disease brain〔J〕.Free Radic Biol Med，2000；28(3)：418-27.