膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1在胃癌及癌周組織中的表達(dá)及臨床意義

趙典朋 徐蕓中 賈麗燕 王曉玲 姚興國

(濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院肝膽外科，山東 濰坊 261000)

胃癌發(fā)病原因目前尚不完全明確，可能與多種基因的異常有關(guān)。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)被認(rèn)為與多種惡性腫瘤的發(fā)生和浸潤有關(guān)〔1〕， 膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(MT1-MMP)是MMPs家族中非常重要的成員，可能參與腫瘤的增殖、凋亡、浸潤、轉(zhuǎn)移以及血管形成等多個(gè)環(huán)節(jié)。本研究對(duì)原發(fā)胃癌及癌旁正常黏膜進(jìn)行免疫組化和PCR分析，并分析不同MT1-MMP水平與臨床特征的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1一般資料 收集我院2007年1月至2009年12月行胃癌手術(shù)切除的病例110例，所有病例均經(jīng)病理證實(shí)為原發(fā)性胃癌；男66例，女44例，年齡60～71〔平均(57.5±5.8)〕歲。其中腺癌49例，包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌與黏液腺癌等；未分化癌20例；黏液癌(即印戒細(xì)胞癌)16例；特殊類型癌25例，包括腺鱗癌、鱗狀細(xì)胞癌、類癌等。按照UICC臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期34例(30.90%)，Ⅱ期29例(26.36%)，Ⅲ期23例(20.90%)，Ⅳ期24例(21.81%)。入選標(biāo)準(zhǔn)：①本次治療屬首次治療，之前未行放化療及手術(shù)治療；②患者無身體其他部位的惡性腫瘤；③術(shù)后均依據(jù)病理類型及分期進(jìn)行足療程化療；④無血液系統(tǒng)的疾病及其他免疫性疾病。

1.2免疫組化 采用免疫組化三步法檢測石蠟切片組織中胃癌和胃癌瘤旁組織中MT1-MMP的表達(dá)情況。新鮮手術(shù)標(biāo)本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、蠟塊成型后，以連續(xù)切片方式，切成4～5 μm厚的切片，抗原修復(fù)，37℃孵育后加入一抗(兔抗人單克隆抗體MT1-MMP，購自中杉金橋生物公司)過夜。預(yù)試驗(yàn)后，設(shè)定最佳實(shí)驗(yàn)濃度為1∶100。二抗Envinsion system(丹麥DAKO公司)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由兩位以上主治醫(yī)師以上級(jí)別病理科醫(yī)師單獨(dú)閱片，并計(jì)算分值。MT1-MMP染色為胞質(zhì)染色，以染色的面積大小以及染色的程度進(jìn)行評(píng)分，0分：陽性面積為0，1分：陽性面積<10%,2分：陽性面積10%～50%,3分：陽性面積51%～80%，4分：陽性面積>80%。染色強(qiáng)度：1分弱陽性，染色為淡黃色；2分中陽性，染色為黃色，仔細(xì)辨認(rèn)可見到棕黃的表現(xiàn)；3分強(qiáng)陽性，染色為棕黃色。總評(píng)分采用面積乘以強(qiáng)度，所得分值即為該標(biāo)本的最后得分。以4分為界，≤4分為低表達(dá)組，以>4分為高表達(dá)組。

1.3RT-PCR 取胃癌組織及癌旁正常黏膜組織塊50～100 mg，研磨成粉末，1 ml Trizol 抽打勻漿，氯仿、異丙醇法抽提RNA，DEPC處理水溶解RNA。RNA變性電泳觀察18 s、28 s條帶，分光光度計(jì)檢測260/280吸光度比值，計(jì)算RNA濃度。在20 μl體系中，加入1 μg總RNA,1 μl oligo dT(500 μg/ml )，RNase-Free水，70℃溫育10 min后立即冰浴冷卻，繼續(xù)加入4 μl 5倍緩沖液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl dNTPs，混勻后42℃保溫2 min，加入1 μl( 200 U)的反轉(zhuǎn)錄酶，42℃繼續(xù)溫育50 min。70℃15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后可以儲(chǔ)存在-20℃條件下。PCR引物由上海敏芯生物技術(shù)公司合成，3′-5′:CATCCATGACAACTTTGGTATC,5′-3′:CCCCATAAAGTTGCTGGATG。反應(yīng)條件為94℃ 2 min，55℃ 1 min，72℃ 2 min 為第一步1個(gè)循環(huán)；94℃ 45 s，55℃ 40 s，72℃ 1 min為第二步30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min延伸。應(yīng)用RT-PCR儀自帶分析軟件，產(chǎn)生PCR擴(kuò)增曲線。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化染色觀察MT1-MMP在不同病理類型胃癌和癌旁組織中的表達(dá) 110例患者中高表達(dá)組(>4分)74例，其中腺癌34例，未分化癌13例，黏液癌10例，特殊類型癌17例；Ⅰ期10例，Ⅱ期18例，Ⅲ期22例，Ⅳ期24例。低表達(dá)組(≤4分)36例，其中腺癌15例，未分化癌7例，黏液癌6例，特殊類型癌8例，Ⅰ期24例，Ⅱ期11例，Ⅲ期1例，Ⅳ期0例。而瘤旁組織僅有5例呈低表達(dá)，其余均未見明顯表達(dá)(圖1)。

2.2RT-PCR檢測MT1-MMP mRNA表達(dá) 正常黏膜組織與胃癌組織之間MT1-MMP mRNA水平比較具有明顯差異，Ⅰ、Ⅱ期胃癌與Ⅲ、Ⅳ期胃癌之間MT1-MMP mRNA水平比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

A：癌旁組織未見明顯表達(dá)；

B：Ⅳ期胃癌見明顯胞質(zhì)染色

表1 不同分期胃癌和癌旁組織的MT1-MMP mRNA表達(dá)

2.3MT1-MMP表達(dá)水平與胃癌臨床特征的關(guān)系 性別、年齡、出現(xiàn)黑便、嘔血、急性腹膜炎等并發(fā)癥與MT1-MMP表達(dá)情況無相關(guān)性，而患者腫瘤早期轉(zhuǎn)移、2年復(fù)發(fā)率及生存率與MT1-MMP表達(dá)情況具有一定的相關(guān)性。見表2。

表2 MT1-MMP表達(dá)情況與臨床特征的相關(guān)性〔n(%)〕

3 討 論

目前臨床上對(duì)于胃癌的治療主要是采取手術(shù)加放化療的綜合治療方式，但胃大部切除術(shù)后，患者往往出現(xiàn)較為嚴(yán)重的并發(fā)癥。盡管手術(shù)可以一定程度上延長患者的生存期，但是多數(shù)患者生存質(zhì)量下降，而放化療等治療給患者帶來的痛苦則更加明顯。

MT1-MMP是膜型MMPs家族中最重要的成員之一，文獻(xiàn)報(bào)道〔2〕其在腫瘤的侵襲、擴(kuò)散、細(xì)胞增殖及腫瘤新生血管的形成中具有重要的作用。Yu等〔3〕報(bào)道MT1-MMP可以通過與不同的細(xì)胞因子相互作用而加快腫瘤細(xì)胞的遷移，并且這種影響與細(xì)胞的類型和細(xì)胞外基質(zhì)的成分無關(guān)。MT1-MMP過度表達(dá)的轉(zhuǎn)染子還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，增加癌細(xì)胞的侵襲能力、粘附性等，直接決定腫瘤惡性程度和患者生存期限的重要因素〔4〕。腫瘤血管的生成是影響腫瘤生長速率的重要因素，Williams等〔5〕通過體外血管生成模型試驗(yàn)證明MT1-MMP在富含膠原的環(huán)境中具有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞侵襲和新生血管生成的作用。

本研究結(jié)果顯示在腫瘤組織中MT1-MMP均有表達(dá)，而在瘤旁組織中呈低表達(dá)；而在不同分期的胃癌中，發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者腫瘤中MT1-MMP的表達(dá)水平明顯高于未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者。徐濤等〔6〕檢測123例肝癌組織，依據(jù)腫瘤進(jìn)展程度分為浸潤組和非浸潤組，結(jié)果顯示MT1-MMP在浸潤組的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，并且浸潤組中伴有血清VEGF的升高和腫瘤血管的增加。楊娜等〔7〕也報(bào)道MT1-MMP在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于正常腦組織，并且與膠質(zhì)瘤的分級(jí)相關(guān)，膠質(zhì)瘤級(jí)別越高M(jìn)T1-MMP的表達(dá)越強(qiáng)烈。姚廣裕等〔8〕研究發(fā)現(xiàn)，MT1-MMP可顯著增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞株的浸潤能力，其機(jī)制主要通過激活MMP-2原酶、降解腫瘤周圍的基質(zhì)成分來實(shí)現(xiàn)。

本研究結(jié)果提示，腫瘤轉(zhuǎn)移越早、2年內(nèi)復(fù)發(fā)、生存期短的患者，胃癌組織中MT1-MMP的表達(dá)就越高，這與MT1-MMP在腫瘤組織中的生物學(xué)特性密切相關(guān)，也提示MT1-MMP不僅在腫瘤細(xì)胞株中具有促進(jìn)腫瘤遷移、增殖、浸潤的作用，在實(shí)體腫瘤中同樣對(duì)腫瘤的惡性程度具有影響。

4 參考文獻(xiàn)

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