膠質瘤IDH1基因變異與Ki-67、微血管密度表達的相關性

王 均 楊小朋 鄭 勇 王繼超 魏文淵 洪 宇

(石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000)

膠質瘤是臨床常見的顱內惡性腫瘤，發病率較高，治療效果不佳。其細胞內的IDH1基因易發生變異，主要是其R132位點發生點突變，并且約75%的惡性膠質瘤被發現存在這些變異。通過多項臨床實驗研究表明IDH1基因變異可延長患者的生存期〔1〕。Ki-67是一種細胞核表達的抗原，是膠質瘤細胞增殖活性評估的理想標記物。Mastronardi等〔2〕研究表明Ki-67標記指數(LI)增加，腫瘤的惡性程度增加，其可反映膠質瘤的惡性程度及一定程度提示患者的預后。腫瘤微血管密度(MVD)是評估血管新生的方法，Leon等〔3〕研究顯示其也是評價患者預后的一個指標，正常腦組織中也表達。IDH1基因變異與預后的具體作用機制仍不清楚，IDH1基因是否通過降低膠質瘤的增殖活性降低腫瘤的惡性程度及改變患者的預后仍不清楚。

1 材料與方法

1.1材料 選取2011年1月至2012年6月新疆維吾爾自治區人民醫院神經外科手術標本45例，已經該院倫理委員會批準，患者知情同意。男性26例、女性19例，年齡24～72〔平均(46.37±3.23)〕歲。病理結果按照2000年世界衛生組織(WHO)腦腫瘤病理分級標準，其中Ⅰ級(毛細胞型星形細胞瘤)2例，Ⅱ級(彌漫性星形細胞瘤、纖維型星形細胞瘤、少突膠質細胞瘤、室管膜瘤)16例，Ⅲ級(間變性星形細胞瘤、間變性少突膠質細胞瘤)10例，Ⅳ級(多形性膠質母細胞瘤、膠質肉瘤)12例，將Ⅰ,Ⅱ級歸為低級別,Ⅲ、Ⅳ級歸為高級別。分為變異組20例，Ⅱ級11例、Ⅲ級6例、Ⅳ級3例；未變異組20例，Ⅰ級2例、Ⅱ級5例、Ⅲ級4例、Ⅳ級9例。5例腦外傷內減壓手術所取正常腦組織(額葉或顳葉)標本為空白對照組。冰凍標本采集后均迅速置于液氮中，-80℃凍存備用。IDH1基因變異檢測工作已完成〔4〕。主要試劑有SP試劑盒及鼠抗人CD34、Ki-67單克隆抗體均從上海銳賽生物技術有限公司購得。

1.2MVD免疫組化染色及分析 組織標本常規甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片機切片厚度4 μm，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(SP)行CD34的免疫組化染色。操作步驟：切片脫蠟水化，蒸餾水中5 min，用蒸餾水配制新鮮的3%H2O2室溫封閉10 min蒸餾水洗1次，抗原修復，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫10 min，滴加一抗，置4℃冰箱過夜，過夜后在37℃復溫45 min，PBS洗2次各5 min，滴加生物素標記的二抗孵育30 min，PBS洗2次各5 min，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶孵育30 min，PBS洗2次各5 min，DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度，蒸餾水洗終止染色，蘇木素復染，鹽酸酒精分化，脫水，透明，封片，鏡檢。每組均有陽性及陰性對照，CD34表達陽性為微血管內皮細胞染成棕黃色。鏡下微血管計數，按Weidner〔5〕血管計數法進行，低倍鏡下選擇5個CD34陽性染色最多的區域作為熱點，然后用高倍鏡(×200)在眼網格下0.25 mm2范圍內計數，任何管腔或單一血管內皮細胞被染成棕黃色作為一個微血管計數，5個高倍鏡視野下計數的微血管平均值作為此標本的MVD。

1.3Ki-67檢測及結果分析 組織標本運用SP法行Ki-67免疫組織化學染色，染色方法同血管密度檢測。Ki-67染色腫瘤細胞核有棕黃色著色為陽性，Ki-67 LI按照陽性細胞所占的百分比進行定量分析，由兩名經驗豐富的病理學專業醫生在高倍鏡視野下(×400)計算每100個腫瘤細胞中Ki-67標記陽性細胞所占的百分比，每個組織標本任取10個高倍視野(×400)計數取平均值，兩者的計數取平均值。把Ki-67 LI分為4級：弱陽性(±)，陽性細胞數小于25%；陽性(+)，陽性細胞數25%～50%；中度陽性()，陽性細胞數50%～75%；強陽性()，陽性細胞數大于75%。

1.4統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1MVD檢測結果 變異組MVD較未變異組減低(t=2.328，P=0.025)，空白對照組較變異組及未變異組均降低 (P<0.05)。Ⅰ+Ⅱ級別膠質瘤MVD表達較高級別膠質瘤低(23.94±8.03和45.54±8.19,t=-8.369,P<0.001)，MVD表達隨腫瘤級別增高而增加。見表1和圖1。

2.2Ki-67表達結果 Ki-67在空白對照組不表達，各級膠質瘤中均有表達(圖2)，表達定位于細胞核，細胞核被染成棕黃色，變異組Ki-67表達較未變異組減低(t=2.134，P=0.039)。Ⅰ+Ⅱ級別膠質瘤Ki-67表達較Ⅲ+Ⅳ級別膠質瘤低〔(8.36%±2.84%)vs(25.55%±7.53%),t=9.138，P<0.001〕。Ⅰ～Ⅳ級膠質瘤采用單因素方差分析比較Ki-67表達，組間比較差異有統計學意義(P<0.001)，膠質瘤級別越高Ki-67蛋白表達也越高，見表1。變異組Ki-67表達弱陽性16例，陽性4例；非變異組弱陽性表達12例，陽性8例；兩組差異無統計學意義(χ2=-1.363，P=0.173)。

Ⅰ級 Ⅱ級 Ⅳ級

空白對照組 未變異組低級別膠質瘤 未變異組高級別膠質瘤

表1 各組Ki-67陽性細胞率及MVD表達比較

3 討 論

惡性膠質瘤在每年新增原發惡性腦腫瘤中約占70%。最初發現IDH1基因突變是在膠質瘤的亞型中大規模基因測序〔6〕，IDH1基因變異主要發生在Ⅱ級和Ⅲ級膠質瘤中，較少在Ⅰ級膠質瘤中發生。IDH1基因突變主要在R132位點，并且發現約75%的惡性膠質瘤存在這類突變。學者發現IDH1基因變異發生在膠質瘤形成的早期〔7〕，并通過多項臨床實驗研究表明IDH1基因通過降低NADPH的水平，從而增加膠質瘤對于放療及化療的敏感性，延長患者的生存期〔8〕。

膠質瘤的發生發展是一個多基因分子水平相互作用的復雜過程，不同功能的基因或蛋白水平的相互誘導協同和拮抗。Ki-67是Gerdes等〔9〕發現的一種IgG1單克隆抗體，在增殖細胞中識別一種核心抗原的提呈，而在靜息狀態下的細胞中缺失。隨后的研究提示Ki-67在膠質瘤中是重要的臨床標記物之一〔10〕。現已被廣泛運用于膠質瘤的診斷及預后評價中，同其他反映細胞增殖的臨床指標如DNA聚合酶、細胞增殖核抗原(PCNA)等相比優勢在于Ki-67半衰期較短，蛋白在增殖周期后降解迅速，能更好地反映腫瘤細胞的增殖活性及其惡性程度，提示患者的預后。Ki-67蛋白的高表達水平提示間變型星形細胞瘤患者存活時間較短〔11〕。MVD已被證實是評價侵襲性腫瘤預后的重要指標，有人認為血管密度可能與年齡、性別等有關，Duda等〔12〕研究發現膠質瘤的血管發達但分布不均，腫瘤組織邊緣血管豐富但也有無血管區域，且腫瘤的血管密度與腫瘤內部的位置、患者性別和年齡之間無關聯，說明膠質瘤的預后與年齡、性別等無關聯。新生血管為腫瘤的生長提供必需的氧和營養物質，與多種類型腫瘤的轉移及生存期有關，新生血管的形成會發生多種生理和病理過程，血管的腫瘤的惡變和轉移都依賴血管的生成〔13～15〕。腫瘤血管發育不成熟導致其基底膜不完整或缺乏為腫瘤的轉移提供直接的通道。大多數腫瘤的血管密度越高，是一個不利的預后指標，它增加轉移和復發的風險，膠質瘤也不例外。血管密度的檢測目前較常用的有抗血管內皮細胞CD31、CD34抗原來標記微血管，由于CD31標記的內皮細胞染色較淺〔16〕，計數時難度較大且增加誤差，因此本實驗用CD34標記微血管。

本研究發現，變異組Ki-67蛋白表達較非變異組增高，并隨腫瘤級別增高而增高，這與Yan等〔17〕的研究在初級膠質瘤IDH1基因突變組Ki-67蛋白表達顯著低于野生型組的結論相同，并且IDH1基因變異患者的生存期延長與IDH1基因突變伴隨增殖率降低有關。本研究結果表明腫瘤惡性程度越高Ki-67蛋白高表達，此結論與以往相關研究〔18～20〕結果相同。膠質瘤細胞中Ki-67表達增高表明腫瘤細胞數量增多，細胞增殖活躍，惡性程度增加，預后較差。本實驗Ki-67表達較其他研究偏低，等級比較差異無統計學意義，這可能與陽性細胞的定義有關，由于一些染色較弱的陽性細胞被歸為陰性細胞。微血管在正常腦組織中也表達，但本實驗膠質瘤標本中表達明顯高于正常腦組織，說明膠質瘤生長迅速所需營養物質和耗氧增加，新生血管適應性增多。隨腫瘤級別增高MVD有增高的趨勢，因此MVD可作為預測腫瘤惡性程度的指標。IDH1基因變異影響新生血管的形成，導致腫瘤血管生成減低，侵襲性及惡性程度降低。Chaloob等〔21〕研究顯示MVD和Ki-67蛋白表達之間有顯著相關性，膠質瘤細胞增殖能力增強，腫瘤新生血管密度增多。

本研究結果間接提示IDH1基因變異影響腫瘤的能量代謝，而能量代謝受阻降低細胞的增殖活性，使大量細胞處于休眠期，導致新生血管內皮細胞分裂緩慢，新生腫瘤血管數量減低，惡變和轉移受到抑制，患者的預后較好。IDH1基因突變雖是一個良好的膠質瘤臨床療效標記物〔22～24〕，但其在膠質瘤中的發生發展機制仍未完全清楚，本實驗證實基因突變對腫瘤增殖活性有一定影響，但尚需完全明確其對腫瘤增殖的影響。

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