老年宮頸鱗癌術后組織中Geminin、組織蛋白酶D和增殖細胞標志物67表達的關系

張 紅 尤正芳

(復旦大學附屬中山醫院青浦分院婦科，上海 201700)

子宮頸鱗狀細胞癌發病率呈雙峰形，即在青年人和老年人多發。老年宮頸癌常與人乳頭瘤狀病毒(HPV)感染不相關，即與病毒無關，而與癌基因及相關蛋白的表達失常密切相關。細胞周期相關因子Geminin是位于細胞核的小分子多功能蛋白，具有復雜的結構和功能區域，并在細胞增殖、胚胎發育和腫瘤生長方面發揮重要作用〔1，2〕。組織蛋白酶(Cath)-D是具有肽鏈內切酶活性的蛋白，是在缺氧時誘導產生的蛋白之一，Cath-D高表達時不僅可以調節腫瘤細胞的增殖過程，還可能對脈管形成有一定作用〔3〕。增殖細胞標志物(Ki)67是與細胞周期密切相關的細胞增殖標志物，其在G1、S、G2和M期有表達，而在G0期無表達〔4〕。目前認為Ki67是最理想的標記腫瘤細胞增殖的蛋白。本文探討老年子宮頸鱗狀細胞癌術后組織中Geminin、Cath-D和Ki67的表達及其相關性。

1 材料和方法

1.1臨床資料 2010年1月至2012年12月我院婦產科行子宮頸鱗狀細胞癌根治手術的老年患者132例作為觀察組，術后立即取組織，放于-80℃冰箱中待檢。納入均依據WHO標準，并經病理學醫師再次核對。年齡60～84〔平均(69.0±6.2)〕歲。其中角化型鱗癌40例，非角化型鱗癌92例。手術前均未進行放、化療。同時選取老年子宮脫垂并診斷為慢性子宮頸炎的老年宮頸鱗狀上皮組織70例作為對照組，術后立即取組織，放于-80℃冰箱中待檢。年齡60～80〔平均(67.5±5.5)〕歲。兩組一般臨床資料無明顯差別，具有可比性。

1.2流式細胞術檢測Geminin、Cath-D和Ki67的表達 Geminin、Cath-D和Ki67蛋白的濃縮液均由武漢博士德生物工程有限公司代購。在正式實驗前應用免疫組化方法進行預實驗，依不同比例進行稀釋，選擇染色最理想的濃度進行流式細胞術的正式實驗。取出凍存組織，置于75%酒精中固定24～48 h后，制備組織的單細胞懸液(1×106/ml)，取1 ml，分別加入Geminin、Cath-D或Ki67一抗，在室溫中孵育30 min，加入PBS 10 ml洗滌一次，棄上清，加入FITC-IgG二抗工作液100 μl，避光室溫孵育30 min，加入PBS 10 ml離心同上，棄上清。加入PBS 0.1 ml，過濾后用上機檢測(美國BC公司生產的流式細胞儀)，應用 Expo 32 ADC進行免疫熒光數據分析。

1.3Geminin、Cath-D和Ki67的判定方法 以熒光指數(FI)表示Geminin、Cath-D和Ki67蛋白表達的相對含量。FI=蛋白表達的熒光強度/對照樣品平均熒光強度。

1.4統計學方法 應用SAS6.12軟件進行t檢驗和相關分析。

2 結 果

2.1兩組Geminin、Cath-D和Ki67的表達比較 觀察組Geminin、Cath-D和Ki67的表達量明顯高于對照組(P<0.000 1)。見表1。

表1 兩組中Geminin、Cath-D和Ki67表達水平比較

2.2觀察組不同臨床特征患者Geminin、Cath-D和Ki67表達比較 觀察組Geminin、Cath-D和Ki67表達與腫瘤的最大徑、是否累及宮頸管及臨床分期密切相關(P<0.05)。見表2。

2.3觀察組Geminin、Cath-D和Ki67表達的關系 觀察組Geminin和Ki67(r=0.58，P=0.011 2)、Cath-D和Ki67(r=0.47，P=0.027 4)的表達均具有正相關性。

表2 觀察組不同臨床特征患者Geminin、Cath-D和Ki67表達的比較

3 討 論

老年患者癌變常起源于萎縮的鱗狀上皮，常常是非HPV感染相關的。由于老年患者常伴有退性改變及激素分泌減少，因此其癌變過程可能更復雜。近年研究表明老年患者宮頸鱗狀上皮的異常增殖是引起病變的重要因素，因此促進增殖的基因和蛋白起的作用較為明顯〔4,5〕。Geminin是1998年發現的一種小分子蛋白，其有二種異構體，即H型和L型，分別含有219個和216個氨基酸，有研究顯示Geminin是一種核定位蛋白，其第50～116之間的氨基酸序列為典型的雙向核定位信號，常由2個堿性氨基酸簇組成〔6,7〕。也有人認為Geminin在細胞有絲分裂期能夠發生周期特異性降解，使細胞的增殖活性明顯增強，細胞生長迅速〔8〕。近年研究關注Geminin在腫瘤中的表達，并發現其在腫瘤中表達升高〔9,10〕。Cath-D是定位在染色體11p15的基因，也是被普遍認為靠近H-ras的原癌基因〔11〕，其表達產物的分子量為34 kD，為溶酶體內的天冬氨酸蛋白酶。上皮細胞癌變后，Cath-D表達增高，引起自體蛋白的激活，使血漿酶原激活劑和膠原酶中的初始蛋白發生明顯水解，Cath-D可以通過自分泌和旁分泌形式激活Cath-B，加速腫瘤細胞的增殖和細胞的活化。Ki67是常規應用于臨床的一種增殖細胞標志物，其特點是穩定〔12〕，存在于細胞周期的G1、S、G2和M期，其蛋白表達在細胞核中，其功能與細胞的有絲分裂密切相關〔13〕。

本研究的結果提示Geminin、Cath-D和Ki67高表達可以有效促進腫瘤的發生過程。Geminin在作用過程中可以精確地調節DNA復制，在S、G2和M期特異性聚集、阻止MCM2-7與復制特許物有效地連接〔14〕，抑制DNA的過度復制〔15〕。Cath-D作用可能具有多元性，即通過多種通路調節腫瘤進展，如其作為雌激素調節的溶酶體蛋白酶，調節腫瘤細胞外基質的降解，加速腫瘤進展，其次Cath-D還可以促進腫瘤的血管生成，為腫瘤提供其生長必需的氧和營養〔16〕。本文結果提示Geminin、Cath-D和Ki67參與腫瘤的生長及侵犯，與腫瘤的進展關系密切。由于以上因素均為臨床判斷腫瘤生物學過程及預后的相關指標，因此術后常規檢測組織中Geminin、Cath-D和Ki67的表達，對判斷腫瘤生物學行為及初步判斷患者預后可能有一定價值〔17〕。Geminin、Cath-D與Ki67之間具有正向協同作用，也提示Geminin和Cath-D通過影響Ki67表達的增殖指數，發揮促進腫瘤生長及癌性增生的作用。但是其作用機制及作用途徑有待更多基礎實驗證實。

4 參考文獻

1楊 寧，柳惠圖，張 偉，等.多功能蛋白Geminin的研究進展〔J〕.生物化學與生物物理進展，2007；34(9)：915-24.

2Nishihara K，Shomori K，Tamura T，etal.Immunohistochemical expression of geminin in colorectal cancer：implication of prognostic significance〔J〕.Oncol Rep，2009；21(5)：1189-95.

3Fukuda ME，Iwadate Y，Machida T，etal.Cathepsin D is a potential serum marker for poor prognosis in glioma patients〔J〕.Cancer Res，2005；65(12)：5190-4.

4Conesa-Zamora P，Torres-Moreno D，Isaac MA，etal.Gene amplification and immunohistochemical expression of ERBB2 and EGFR in cervicalcarcinogenesis.Correlation with cell-cycle markers and HPV presence〔J〕.Exp Mol Pathol，2013；95(2)：151-5.

5Rainsbury JW，Ahmed W，Williams HK，etal.Prognostic biomarkers of survival in oropharyngeal squamous cell carcinoma：systematic review and meta-analysis〔J〕.Head Neck，2013；35(7)：1048-55.

6周葉萍，舒茂琴.Geminin在血管平滑肌細胞分化表型轉化中的介導作用〔J〕.第三軍醫大學學報，2010；32(17)：1816-8.

7周葉萍，舒茂琴.Geminin在細胞周期中的作用研究進展〔J〕.重慶醫學，2010；39(24)：3432-4.

8Kim HE，Kim DG，Lee KJ，etal.Frequent amplification of CENPF，GMNN and CDK13 genes in hepatocellular carcinomas〔J〕.PLoS One，2012；7(8)：e43223.

9Haruki T，Shomori K，Hamamoto Y，etal.Geminin expression in small lung adenocarcinomas：implication of prognostic significance〔J〕.Lung Cancer，2011；71(3)：356-62.

10Shomori K，Nishihara K，Tamura T，etal.Geminin，Ki67，and minichromosome maintenance 2 in gastric hyperplastic polyps，adenomas，and intestinal-type carcinomas：pathobiological significance〔J〕.Gastric Cancer，2010；13(3)：177-85.

11Sebzda T，Saleh Y，Gburek J，etal.Cathepsin D expression in human colorectal cancer：relationship with tumour type and tissue differentiation grade〔J〕.J Exp Ther Oncol，2005；5(2)：145-50.

12May M，Burger M，Otto W，etal.Ki-67，mini-chromosome maintenance 2 protein (MCM2) and geminin have no independent prognostic relevance for cancer-specific survival in surgically treated squamous cell carcinoma of the penis〔J〕.BJU Int，2013；112(4)：E383-90.

13劉 謙，路名芝，歐陽斌焱，等.非小細胞肺癌中Geminin、Ki67的表達及其預后意義〔J〕.臨床與實驗病理學雜志，2014；30(3)：279-81.

14Yellajoshyula D，Lim JW，Thompson DM Jr，etal.Geminin regulates the transcriptional and epigenetic status of neuronal fate-promoting genes during mammalian neurogenesis〔J〕.Mol Cell Biol，2012；32(22)：4549-60.

15Yang VS，Carter SA，Hyland SJ，etal.Geminin escapes degradation in G1 of mouse pluripotent cells and mediates the expression of Oct4，Sox2，and Nanog〔J〕.Curr Biol，2011；21(8)：692-9.

16Jacobson-Raber G，Lazarev I，Novack V，etal.The prognostic importance of cathepsin D and E-cadherin in early breast cancer：a single-institution experience〔J〕.Oncol Lett，2011；2(6)：1183-19.

17Yamazaki M，Fujii S，Murata Y，etal.High expression level of geminin predicts a poor clinical outcome in salivary gland carcinomas〔J〕.Histopathology，2010；56(7)：883-92.