老年腎病綜合征患者血漿miRNA的異常表達與臨床意義

楊 軍 朱鐵錘 劉向東

(新鄉醫學院第一附屬醫院腎內2科，河南 新鄉 453100)

腎病綜合征如不及時進行診療，發展到后期將會導致出現腎衰竭〔1,2〕。目前，對于老年腎病綜合征的診斷主要依靠臨床癥狀，靈敏性和特異性較低；腎活檢雖然準確性較大，但為有創檢查，易出現并發癥。近年來，隨著血漿miRNA在許多疾病中研究的不斷深入，miRNA成為疾病診療研究的熱點之一〔3〕，但是在老年腎病綜合征中的研究較少。本研究通過觀察老年腎病綜合征患者中miRNA的表達差異，為miRNA在老年腎病綜合征診斷和預后判斷中的應用提供依據。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取2012年3月至2013年3月住院治療的老年腎病綜合征患者60例作為研究組，年齡60～75〔平均(64.26±4.48)〕歲，男38例，女22例。選取同時期來我院進行健康體檢的老年患者15例作為對照組，年齡60～73〔平均(63.37±4.24)歲〕，男10例，女5例。研究組患者均經腎活檢確診，主要為膜性腎病(MN)、微小病變型腎病(MCNS)、局灶性節段性腎小球硬化癥(FSGS)各20例。兩組患者的年齡、性別無明顯差異，具有可比性(P>0.05)。但研究組的24 h尿蛋白、血漿白蛋白、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)與對照組相比存在明顯差異(P<0.05)。見表1。本研究經醫院倫理委員會批準通過，并經患者知情同意。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

1.2血漿標本 用EDTA-K2血液采集管分別收集研究組患者治療前后的空腹靜脈血2 ml以及對照組靜脈空腹血2 ml，輕輕顛倒3次，1 500 r/min常溫離心10 min，取上清液轉入新的無酶EP管中。12 000 r/min 4℃離心10 min，小心吸取上層清液轉入干凈的無酶EP管中。將離心好的血漿樣本分裝，-80℃保存備用。

1.3試劑 DEPC水為美國AMRESCO公司產品； miRcute miRNAs提取分離試劑盒(DP501)購自北京天根生化科技有限公司；TaKaRa逆轉錄試劑盒(DDR037A)、TaKaRa PCR擴增試劑盒(DDR420A)購自大連寶生物工程有限公司。選取鼠的miR-295-3p作為血漿miRNA的檢測內參，其序列為：5'-AAAGUGCUACUACUUUUGAGUCU-3'，PCR引物均由上海生工生物工程公司合成，序列見表2。

表2 miRNA的序列及實時定量RT-PCR的引物序列

1.4血漿miRNAs分離和qRT-PCR 按照試劑盒的操作說明書進行miRNAs的提取。逆轉錄體系： Template miRNA 2 μl，RT引物(1ug/μl)，3 μl，RNase-free ddH2O 6 μl，lin4 10 fmol，AMV引物 1 μl；反轉錄的反應條件為 16℃ 25 min，42℃ 60 min，70℃ 10 min，逆轉錄產物保存于-20℃。PCR反應液包含：ddH2O 8.0 μl，PCR前向、反向引物各0.50 μl，模板 cDNA 1.0 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)10.0 μl，反應條件: 94℃ 3 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 50 s，72℃ 10 min，一共進行45個循環。

數據分析采用公式：△Ct研究組= Ct研究組基因-Ct 研究組內參照;△Ct對照組= Ct 對照組基因- Ct對照組內參照; △△Ct =△Ct研究組-△Ct 對照組。

2 結 果

2.1三組miRNA在兩組血漿中的表達情況和診斷中的應用 研究組血漿miR-181a， miR-192和miR-141的表達水平均較對照組明顯升高(P<0.01)。ROC曲線分析顯示他們作為診斷標記物診斷老年腎病綜合征的診斷效能較高(AUC>0.9)，診斷特異性和敏感性達到90%～100%。見表3，圖1。

2.2三組血漿游離miRNA在不同腎病綜合征病理類型的表達水平 miR-181a在MN組患者血漿中表達水平明顯高于其他組，MCNS組血漿miR-141表達水平明顯高于其他組，FSGS組血漿miR-192表達水平明顯高于其他組。見圖2。

表3 兩組患者血漿miRNA表達水平的比較

圖1 血漿miRNA診斷老年腎病綜合征的ROC曲線

與FSGS、MCNS比較：1)P<0.005；與MN、MCNS比較：2)P<0.05；與MN和FSGS比較：3)P<0.05

2.3三種血漿游離miRNA與腎病綜合征治療的關系 研究組患者治療1個療程后，血漿miR-181a、miR-192、miR-141表達水平較治療前明顯降低(P<0.05)，且與對照組比較沒有顯著差異(P>0.05)。見圖3。

對照組比較：1)P<0.05；與術前比較：2)P<0.05

3 討 論

隨著人類對于疾病基因表達差異性的不斷研究，發現體液中miRNA與許多疾病存在明顯的相關性，逐步被應用為疾病診斷的生物學標志〔4,5〕。研究發現血液中的miRNA穩定性高，耐酸、耐堿、耐高溫且抗RNA酶干擾性強，具有高度保守性的序列，準確性高，并且創傷小，易獲取標本。既往相關研究發現，血漿中一些miRNA與腎臟疾病存在明顯的相關性〔6～8〕。

通過既往相關研究報道和基因庫篩選，本研究選取miR-181a、miR-192和miR-141作為研究對象，發現老年腎病綜合征組血漿三種miRNA表達水平較對照組明顯升高，ROC曲線發現其敏感度和特異度均在90%以上，可見三種miRNA可以顯著區分老年腎病綜合征患者和健康受檢者。既往研究發現，miR-181a、miR-192和miR-141可以通過誘導膠原的合成、激活TGF-β1和AKT等相關通路，進而導致腎小球硬化的發生，但是具體在不同病理類型中的變化機制尚不清楚〔9～11〕。本研究結果將有助于差異表達miRNA在腎病綜合征病理分析中的應用，并提示三種miRNA的表達水平與腎病綜合征治療的效果存在相關性。

總之，檢測血漿miRNA能特異和敏感診斷腎病綜合征，提示miRNA可以作為老年腎病綜合征診斷的一種非侵襲性的血漿標志物，此外，血漿miRNAs與老年腎病綜合征的病理分型、臨床治療都有顯著的相關性。

4 參考文獻

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