氫飽和鹽水對阿爾茨海默病模型大鼠氧化應激損傷的影響

李 健 劉春娜 劉新宇 李熙東 劉媛媛

(遼寧醫學院附屬第一醫院神經內科，遼寧 錦州 121001)

活性氧自由基(ROS)可以直接或間接氧化或損傷DNA、蛋白質和脂質，可誘發基因的突變、蛋白質變性和脂質過氧化，被認為是人體衰老和各種重要疾病如腫瘤、心腦血管疾病、神經退行性疾病(老年癡呆)、糖尿病最主要的危險因子。在阿爾茨海默病(AD)病人的尸檢中發現,腦組織的脂質發生嚴重過氧化,自由基生成增加,細胞核和線粒體的DNA均損傷,其中線粒體的DNA損傷最嚴重。2007年日本學者首先報道，氫溶解在液體中可以選擇性中和氧化損傷的重要介質羥自由基和亞硝酸陰離子〔1〕，動物呼吸2%的氫可以顯著改善腦缺血再灌注損傷，目前已報道了氫氣對多種疾病的治療作用，主要集中在器官缺血再灌注損傷〔2,3〕、器官移植損傷〔4,5〕、炎癥及變態反應疾病〔6,7〕、代謝綜合征〔8〕、減輕放療、化療的毒性作用〔9〕、部分神經系統變性疾病等〔10〕，但對AD學習記憶功能的影響尚未見報道。本實驗擬考察氫飽和鹽水對AD模型大鼠化應激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1主要試劑 丙二醛(MDA)，南京建成；4-羥基壬烯醛(HNE)，Alpha，USA；纖維酸性蛋白(GFAP)，Biotime，China；腫瘤壞死因子(TNF)、白介素(IL)-6、IL-1β，R&D，USA；8-羥基脫氧鳥苷酸(8-OH-dG)，Groundwork，USA。

1.2主要儀器 分光光度計、酶標儀、切片機、普通光學顯微鏡、照相系統、超低溫冰箱，微量冷凍離心機，高速冷凍離心機，精密分析天平、震蕩水浴等。

1.3MDA測定 斷頭處死大鼠,冰盤上快速取腦,將右側腦組織(去除嗅球和小腦,取大腦中前段)用冰生理鹽水沖洗濾紙吸濕后,稱取皮層腦組織濕重0.3 g,加入預冷的生理鹽水,用勻漿器制成10%(皮質重量mg/生理鹽水體積μl)的組織勻漿,4℃ 3 500 r/min,離心10 min,提取上清液,-20℃凍存待檢。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法,應用752型分光光度計測定。

1.4免疫組化測定4-羥基壬烯醛(HNE)、8-羥基脫氧鳥苷(8-OH-d G)的表達 將腦組織按固定、脫水、石蠟步驟處理后，進行連續切片，片厚 5 μm，每個腦組織切片 3 張，石蠟切片常規二甲苯脫蠟梯度酒精水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次×3 min。用封閉通透液浸潤切片30 min，PBS洗3次×3 min。切片放入0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖溶液(pH6.0)后，在微波爐里高火4 min至沸騰后，再加熱約6 min×4次。PBS溶液洗3次×3 min；將切片取出,周圍水分用濾紙吸干,用組化筆在組織周圍畫上圈,在圓圈內組織滴入5%羊血清后放入濕盒中,室溫30 min。甩去切片上的羊血清,用濾紙擦干組織周圍殘留血清，直接加入已稀釋的一抗(1∶250、500、1 000)后，放入濕盒中室溫1 h，然后4℃過夜，從冰箱中取出需37℃復溫45 min。將一抗倒掉并用PBS洗5 min×5次；用濾紙將圓圈周圍的水吸去，加入已稀釋的二抗后放入37 ℃恒溫烤箱中30 min(回收)，用PBS洗5次×5 min。用二氨基聯苯胺(DAB)顯色檢測，蘇木素復染，中性樹膠封固。按免疫組織化學程序檢測HNE、8-OH-d G的表達;表達陽性的細胞在光鏡下細胞質或細胞核呈棕黃色或棕褐色顆粒。圖像分析采用Image pro plus圖像分析軟件，在每個視野相同部位選定相同面積組織區域，計算陽性細胞，每個切片取3個區域計數。觀察部位可選擇海馬、皮層及內嗅區、基底前腦等。

1.5統計學方法 應用SPSS10.0軟件進行單因素方差分析、LSD、Student-Newman-Keuls分析。

2 結 果

2.1氫飽和鹽水對腦組織MDA含量的影響 模型組大鼠腦組織MDA含量為(6.65±1.07)nmol/mgprotein，與假手術組〔(4.18±0.78)nmol/mg protein〕相比顯著升高(P=0.000)，而氫飽和鹽水治療組大鼠腦組織的MDA含量〔(5.53±0.74)nmol/mg protein〕較模型組大鼠顯著降低(P=0.016)。

2.2氫飽和鹽水對腦組織HNE表達的影響 給予氫飽和鹽水治療后14 d，海馬齒狀回細胞被染成棕黃色，呈現HNE陽性細胞。模型組大鼠海馬齒狀回顯現較多的HNE陽性細胞(11.17±3.43)，假手術組大鼠鮮見HNE陽性細胞(0.50±0.84)，而氫飽和鹽水治療組大鼠海馬齒狀回HNE陽性細胞(7.33±1.75)較模型組大鼠顯著減少(P=0.011)。見圖1。

2.3氫飽和鹽水對腦組織8-OH-d G 表達的影響 海馬齒狀回呈現棕黃色8-OH-d G染色陽性細胞。與假手術組(4.67±1.75)相比，模型組大鼠海馬齒狀回出現明顯增多的8-OH-d G染色陽性細胞(19.17±4.30)(P=0.000)，而經氫飽和鹽水治療后的模型大鼠海馬齒狀回8-OH-d G染色陽性細胞(10.50±2.71)明顯減少(P=0.000)。見圖2。氫飽和鹽水治療后10 d，頂葉皮層呈現棕黃色8-OH-d G染色陽性細胞。與假手術組(1.83±1.62)相比，模型組大鼠頂葉皮層出現明顯增多的8-OH-d G染色陽性細胞(13.33±2.43)(P=0.000)，而經氫飽和鹽水治療后的模型大鼠頂葉皮層8-OH-d G染色陽性細胞(5.50±1.76)明顯減少(P=0.000)。見圖3。

圖1 各組大鼠腦組織HNE表達陽性細胞(DAB)

圖2 各組大鼠海馬齡狀回8-OH-d G表達(DAB)

圖3 各組大鼠頂葉皮層8-OH-d G表達(DAB)

3 討 論

目前已明確的AD致病基因蛋白APP、ApoE或PS在調節神經元凋亡或結合轉運金屬方面均與氧化應激作用有關〔11〕。Aβ是OS與AD腦神經元死亡之間的耦聯分子。氧自由基也可促進淀粉樣蛋白前體(APP)裂解生成Aβ增加,二者具有相互促進的效應。

老年人在增齡的過程中,腦內自由基的清除能力降低，神經元細胞膜上的不飽和脂肪酸被氧化而產生大量自由基。這些自由基損傷細胞膜、細胞器等細胞內結構,誘導神經元凋亡,導致神經細胞功能嚴重破壞,從而促使AD的形成。氧自由基能促進Aβ的毒性和聚集,使其在腦內過度活躍,導致神經元退行性變而發生AD;而Aβ也使自由基生成增多。有人用轉基因動物對自由基與Aβ的因果關系進行一系列的活體內研究,發現Aβ的沉積能誘導自由基的產生,自由基增多又極大地促進了Aβ的沉積,造成一種神經細胞受損和功能紊亂的惡性循環〔12〕。氧自由基損傷細胞膜結構,生成大量脂質過氧化物,最終產物是MDA,MDA的量可以反映機體內脂質過氧化的程度。本實驗的結果顯示氫飽和鹽水治療可以明顯降低AD模型大鼠腦組織中MDA的水平，提示其清除自由基的能力較強，減少了氧自由基對細胞膜的損傷，從而改善細胞的變性、凋亡或者死亡。HNE是明確的OS標志物，是在AD 造模及相關研究中常用的毒性羰基,它對人工培養的初級神經元、神經瘤細胞、神經膠質細胞等許多細胞功能都有影響。Kim等〔13〕發現在AD 患者腦皮質的某些區域呼吸鏈復合物的活性降低,HNE 抑制神經突觸生成并對Neuro 2A 細胞的微管蛋白網絡起迅速的、實質性的破壞作用。在培養大鼠海馬神經元的過程中,神經元置于含有2 μmol PL的HNE 的培養基中2 h 便會導致Tau 蛋白的磷酸化程度增高,使Tau 蛋白對去磷酸化具有抵抗作用,這可以被AT8 抗體所識別。AD病人的腦室腦脊液及血清中HNE顯著增高也證明其可作為AD的生物標志物〔14〕。加入Aβ1～42培養的神經元HNE含量增高。 HNE 抑制血漿中的膜轉運體，破壞微管排列，抑制線粒體功能。

8-OHdG是羥自由基在DNA堿基的C-4、C-5或C-8位置上與脫氧鳥嘌呤核苷酸殘基結合并進一步氧化生成的,通過檢測血清8-OHdG可以間接反映OS的程度。8-OH-dG是衡量細胞核內基因組DNA氧化損傷程度的重要標志。一些研究〔15,16〕分別觀察到正常衰老過程中機體重要組織和AD患者大腦細胞線粒體和細胞核DNA中8-OH-dG含量明顯升高。8-OH-dG的含量不僅反映DNA損傷程度,還標志機體代謝和修復能力下降。

本實驗觀察到氫飽和鹽水可以降低Aβ1～42誘導的AD模型大鼠腦組織MDA水平，減弱海馬OS損傷標志物HNE、8-OH-d G的免疫反應，提示氫飽和鹽水對Aβ1～42誘導的AD模型大鼠腦組織OS損傷具有保護作用。

4 參考文獻

1Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K,etal. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals〔J〕. Nat Med,2007;13(6):688-94.

2Oharazawa H.Administration in retinal ischemia-reperfusion injury〔J〕. Investi Ophthalmol Vis Sci,2010;51(1):487-92.

3Sun Q, Cai JM, Liu SL,etal. Hydrogen-rich saline provides protection against hyperoxic lung injury〔J〕. J Surg Res, 2011;165(1):e43-e49.

4Cardinal JS, Zhan J, Wang Y,etal.Oral hydrogen water prevents chronic allograft nephropathy in rats〔J〕. Kidney Int, 2010;77(2):101-9.

5Qian L, Mei K, Shen J,etal. Administration of hydrogen-rich saline protects mice from lethal acute graft-versus-host disease (aGVHD) 〔J〕. Transplantation, 2013;95(5):658-62.

6Chen H, Sun YP, Li Y,etal. Hydrogen-rich saline ameliorates the severity of L-arginine-induced acute pancreatitis in rats〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2010;393(2):308-13.

7Spulber S, Edoff K, Hong L,etal. Molecular hydrogen reduces LPS-induced neuroinflammation and promotes recovery from sickness behaviour in mice 〔J〕．PLoS One, 2012;7(7):e42078.

8Kamimura N，Nishimaki K，Ohsawa I，etal． Molecular hydrogen improves obesity and diabetes by inducing hepatic FGF21 and stimulating energy metabolism in db /db mice 〔J〕．Obesity (Silver Spring) ，2011;19(7):1396-403．

9Qian L, Cao F, Cui J,etal. Radioprotective effect of hydrogen in cultured cells and mice〔J〕. Free Radical Res, 2010;44(3):275-82.

10Fujita K，Seike T，Yutsudo N，etal． Hydrogen in drinking water reduces dopaminergic neuronal loss in the 1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson' s disease 〔J〕．PLoS One，2009;4(9) : e7247．

11Butterfield DA,Drake J, Pocernich C,etal. Evidence of oxidative damage in Alzheimer's disease brain:central role for amyloid beta-peptide〔J〕. Trends Mol Med, 2001;7(12):548-54.

12Wang JZ,Wang ZF. Role of melatonin in Alzheimer-like neurodegeneration〔J〕. Acta Pharmacol Sin, 2006;27(1):41-9.

13Kim MS,Lee LJ, Lee WY,etal. Neuroprotective effect of Ginkgo biloba L. extract in a rat model of Parkinson’s disease〔J〕. Phytother Res, 2004;18(8):663-6.

14Ohsawa I,Ishikawa M, Takahashi K,etal. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals〔J〕. Nat Med, 2007;13(6):688-94.

15Hayashida K,Sane M,Ohsawa I,etal. Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury〔J〕. Biochem Biophys Res Commun, 2008;373(1):30-5.

16Ohsawa I, Nishimaki K,Yamagata K,etal. Consumption of hydrogen water prevents atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice〔J〕. Biochem Biophys Res Commun, 2008;377(4):1195-8.