促紅細胞生成素對慢性環孢素A腎毒性細胞凋亡的抑制作用

崔鎮花 樸尚國 金英順 鄒洪斌 苗里寧 金 華 李 燦

(延邊大學附屬醫院腎臟內科，吉林 延吉 133000)

環孢素A(CsA)作為一線免疫抑制劑，長期服用可導致慢性CsA腎毒性，其病理特點為腎小管間質炎癥和纖維化。慢性CsA腎毒性的發病機制極其復雜，由多種因素相互作用所致，包括炎性趨化因子〔1〕、轉化生長因子β1(TGF-β1)〔2〕、腎素血管緊張素系統 (RAS)〔3〕、細胞凋亡〔4〕等。在諸多發病分子機制中，細胞凋亡扮演著重要角色。CsA可以調控凋亡基因促使腎小管上皮細胞進入死亡程序，喪失過多的腎小管上皮細胞從而破壞腎臟正常結構，最終形成纖維化。促紅細胞生成素(EPO)具有細胞保護作用，如保護神經細胞和心肌細胞缺血再灌注損傷。給予大鼠EPO可減少腦梗死面積75%以上〔5〕和心肌細胞凋亡近50%〔6〕。另外，EPO可防治順鉑所致腎損傷〔7〕，EPO預處理可明顯減輕急性腎缺血再灌注損傷〔8〕。然而，關于EPO防治慢性腎臟損傷的報道較少。本實驗旨在探討EPO對慢性CsA腎毒性是否具有抗纖維化、抗細胞凋亡作用。

1 材料與方法

1.1實驗分組 雄性Sprague-Dawley 大鼠28只，體重200～220 g。喂飼低鹽飼料 (0.05% 鈉鹽，Teklad Premier，Madison，WI，美國) 1 w后，隨機分為四組：①對照組(n=6)：皮下注射橄欖油 (1 mg·kg-1·d-1，Sigma，美國)。②對照組+EPO(n=6)：給予橄欖油和EPO(100 U/kg，3次/w腹腔注射)。③CsA毒性組 (n=8)：皮下注射CsA(15 mg·kg-1·d-1，Novartis Pharma，Basel，瑞士)。④CsA+EPO組(n=8)：同時給予CsA和EPO。

各組大鼠4 w后處死，取血樣和腎組織標本。CsA和EPO的劑量和用法選擇基于以往報道〔9，10〕。

1.2基本測定 監測各組大鼠的體重變化；收縮期血壓 (SBP)，采用尾動脈測定法(Tail-cuff，BP2000，Visitech system，Apex，NC，美國) 檢測，每只大鼠測定3次取平均值。全血CsA濃度單克隆放免法測定(Monoclonal Radioimmunoassay，Incstar，Stillwater，MN，美國)。腎功能和血色素用全自動生化分析儀測定(Coulter-STKS，美國)。

1.3腎臟病理 獲取的腎組織由過碘酸-賴氨酸-多聚甲醛液固定，石蠟包埋后切片(厚4 μm)。脫蠟后行三色(Masson Trichrome) 染色，觀察腎小管間質纖維化。TUNEL染色按In Situ Apoptosis測定試劑盒(ApopTag Peroxidase，Intergen Co.，NY，美國)步驟說明檢測細胞凋亡。細胞凋亡和腎小管間質纖維化程度利用數字化顯微鏡分析儀 (TDI Scope Eye Version3.0 for Windows，Olympus，日本)，在100倍顯微鏡下，每張切片上至少觀察非重疊20個不同區域，獲取圖像，利用 Polygon 程序計算TUNEL陽性細胞數和腎小管間質纖維化的百分比(%/0.5 mm2)。由兩個觀察者對每個樣本隨機進行盲法評分，取平均值。

1.4RNA 原位雜交 利用 DIG RNA 標記的試劑盒制備 TGF-β1誘導基因h3(βig-h3) 特異探針，取石蠟包埋的切片按照常規方法進行原位雜交。二甲苯脫蠟和梯度酒精中脫水，室溫下 (37℃) 0.3% 過氧化氫/甲醛30 min處理后，PBS液洗3次。置微波爐中加熱5 min修復抗原(98℃)，PBS 液洗3次。分別置0.2 mol/L鹽酸和1%Triton X-100溶液中15 min，室溫下與10 μg/ml蛋白酶K (Boehringer Mannheim，Mannheim，德國) 浸漬20 min，2倍SSC溶液沖洗后在含有50%去離子的甲醛、4倍SSC、2倍Dehardt’s、1 mg/ml salmon-sperm DNA、1 mg/ml yeast transfer RNA液中與0.3 ng/μl digoxigenin-labeled sense或抗βig-h3特異探針過夜進行雜交。室溫下切片0.1倍SSC沖洗后，雜交過的探針用羊抗-DIG抗體(Fab)結合堿性磷酸酶標記，以NBT/X-磷酸酶(Boehringer Mannheim，Mannheim，德國)顯影。

1.5免疫印跡法 腎組織用蛋白質溶解緩沖液 (10 mmol/L Tri-Cl，pH7.6；150 mmol/L NaCl；1% Sodium deoxycholate；1% Triton X 100；0.1% Sodium dodecyl sulfate；1% aprotinin；2 mmol/L Na3VO4；1 μg/ml leupeptin；1 mmol/L PMSF) 制成勻漿；4℃離心(1 500 r/min) 后，取上清液測定蛋白濃度 (Bio-Rad，Hercules)；20 μg 標本在十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；電轉膜 (90 V) 2 h后，4℃下 置Bcl-2抗體于非脂牛乳中以1∶1 000 濃度孵育12～16 h；室溫下緩沖液洗3次，加辣根過氧化物酶標記的驢抗兔IgG (Amersham Biosciences Buckinghamshire，英國)以1∶2 000濃度孵育1 h；室溫下緩沖液液洗3次，增強發光 (ECLTM，Amersham Biosciences，Seoul，韓國) 和曝光。Bax、Fas、βig-h3的免疫印跡方法與Bcl-2類似。以β-actin為參照，對照組為100%標準進行條帶分析。

2 結 果

2.1EPO對體重、血壓、貧血、腎功能的影響 CsA腎毒性組大鼠體重下降、 貧血、腎功能惡化。EPO治療明顯改善CsA所致的貧血和體重下降，但不能改善腎功能；然而各組間血壓無顯著性差異。見表1。

表1 各組大鼠腎功能及基本數據變化

2.2EPO對腎小管間質纖維化的影響 與對照組相比，CsA毒性組表現為明顯的纖維化形成〔(23±3)% vs.(0±0)%，P<0.01〕；EPO〔(10±2)% vs.(23±3)%，P<0.05〕顯著減少纖維化程度。

2.3EPO對βig-h3表達的影響 RNA 原位雜交顯示CsA明顯增加βig-h3 mRNA的表達，而EPO抑制其表達。與RNA 原位雜交結果一致，免疫印跡結果表明EPO明顯抑制βig-h3蛋白的表達〔(290±27)% vs.(637±84)%，P<0.01〕。

2.4EPO對細胞凋亡的影響 CsA促進細胞凋亡，表現為TUNEL陽性細胞數的增加〔(56.2±6.4) vs.(11.0±0.8)，P<0.01〕，主要定位于腎小管上皮細胞，EPO顯著減少TUNEL陽性細胞數〔(30.8±4.9) vs.(56.2±6.4)，P<0.05〕。

2.5EPO對細胞凋亡相關基因表達的影響 與對照組相比，CsA不僅引起腎小管上皮細胞凋亡，而且還調控相關基因的表達，表現為抑制抗細胞凋亡基因Bcl-2的表達〔(33±4)% vs.(100±6)%，P<0.01〕，反之上調促凋亡基因Bax〔(784±57)% vs.(100±10)%，P<0.01〕和Fas的表達〔(279±36)% vs.(98±15)%，P<0.01〕；EPO治療逆轉上述基因的表達。

2.6相關關系 直線相關分析表明，腎間質纖維化程度與βig-h3蛋白表達(r=0.835，P<0.001)、TUNEL陽性細胞數正相相關(r=0.698，P<0.001)。

3 討 論

作為抗貧血藥物，EPO常用于治療慢性腎衰竭病人，本研究結果表明，EPO明顯減少腎小管間質纖維化，而腎小管間質纖維化程度與細胞凋亡緊密相關；在分子水平上，EPO抑制βig-h3的表達，同時調控細胞凋亡相關基因、減少腎小管上皮細胞凋亡。因此，本文提示EPO對慢性CsA腎毒性具有抗纖維化作用。

致纖因子TGF-β1參與了各種慢性腎臟疾病的腎小球硬化和纖維化過程如糖尿病腎病〔11〕、單側輸尿管梗阻〔12〕、慢性CsA腎毒性〔2〕，但是組織器官中的TGF-β1并不具有生物學活性，需體內激活。βig-h3是一種基質蛋白，被TGF-β1調控，大量研究表明，βig-h3可用來真實地反映TGF-β1的生物學活性，在慢性CsA腎毒性腎小管間質纖維化中起著重要作用〔13〕。本實驗結果表明，EPO治療明顯改善CsA所致的腎小管間質纖維化，同時βig-h3 mRNA和蛋白的表達下調。所以，在慢性CsA腎毒性中，EPO抑制βig-h3的表達而發揮抗纖維化作用。

細胞凋亡及其調控基因在慢性CsA腎毒性腎小管間質纖維化的發病中起到重要作用。CsA可直接地引起腎小管上皮細胞凋亡。Ortiz 等〔14〕報道給予小鼠近曲腎小管上皮MCT細胞CsA導致劑量和時間依賴性的細胞凋亡。另外，CsA還可通過 TGF-β1 間接地引起腎小管上皮細胞凋亡，給予ICR小鼠特異性抗 TGF-β單克隆抗體明顯減少腎小管上皮細胞凋亡近48%〔15〕。在慢性CsA腎毒性中，本課題組曾報道細胞凋亡調控基因Bcl-2、Bax、Fas等參與了腎小管間質纖維化過程〔16〕。在本實驗中，免疫印跡結果表明EPO上調抗凋亡基因Bcl-2的表達，抑制凋亡基因Bax和Fas的表達，使Bcl-2/Bax比率增加，有利于細胞存活，表明EPO通過調控Bcl-2/Bax和Fas減少細胞凋亡。

Parsa等〔17〕和Yang等〔18〕分別報道EPO抑制缺血所致腎小管上皮細胞或心肌細胞凋亡而不依賴于其抗貧血作用，說明EPO具有直接的抗細胞凋亡作用。筆者推測EPO可通過改善腎缺血缺氧、減少氧化應激等機制糾正貧血，改善了慢性CsA腎毒性。有趣的是，EPO減少CsA導致的腎小管間質纖維化，但病理學改善并不伴有腎功能的好轉，這種現象可能與慢性CsA腎毒性的動物模型特點相關，因為慢性CsA腎毒性動物模型僅在低鹽飼料下才能誘導。低鹽飼料激活RAS，最終導致腎功能惡化和病理學改變，與在臨床上觀察到的慢性CsA腎毒性極為相似。但在該動物模型中，用洛沙坦阻斷RAS僅能改善腎臟結構變化而不能逆轉腎功能惡化〔19〕。相反，使用特異性的血管內皮素抗體能改善腎功能卻又不能改善腎小管間質纖維化〔20〕。由此推斷EPO對慢性CsA腎毒性的保護作用是通過非血流動力學途徑完成的。

4 參考文獻

1Lee S，Kim W，Kim DH，etal.Protective effect of COMP-angiopoietin-1 on cyclosporine-induced renal injury in mice〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2008;23(9)：2784-94.

2Endo A，Someya T，Nakagawa M，etal.Synergistic protective effects of mizoribine and angiotensin Ⅱ receptor blockade on cyclosporine A nephropathy in rats〔J〕.Pediatr Res,2014;75(1-1)：38-44.

3Yoon HE，Ghee JY，Piao S，etal.Angiotensin Ⅱ blockade upregulates the expression of Klotho，the anti-ageing gene，in an experimental model of chronic cyclosporine nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2011;26(3)：800-13.

4Nam HK，Lee SJ，Kim MH，etal.Rosuvastatin attenuates inflammation，apoptosis and fibrosis in a rat model of cyclosporine-induced nephropathy〔J〕.Am J Nephrol,2013;37(1)：7-15.

5Brines ML，Ghezzi P，Keenan S，etal.Erythropoietin crosses the blood-brain barrier to protect against experimental brain injury〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2000;97(19)：10526-31.

6Calvillo L，Latini R，Kajstura J，etal.Recombinant human erythropoietin protects the myocardium from ischemia-reperfusion injury and promotes beneficial remodeling〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2003;100(8)：4802-6.

7Kong D，Zhuo L，Gao C，etal.Erythropoietin protects against cisplatin-induced nephrotoxicity by attenuating endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis〔J〕.J Nephrol,2013;26(1)：219-27.

8Ahmadiasl N，Banaei S，Alihemmati A，etal.The anti-inflammatory effect of erythropoietin and melatonin on renal ischemia reperfusion injury in male rats〔J〕.Adv Pharm Bull,2014;4(1)：49-54.

9Xiang Y，Piao SG，Zou HB，etal.L-carnitine protects against cyclosporine-induced pancreatic and renal injury in rats〔J〕.Transplant Proc,2013;45(8)：3127-34.

10Vaziri ND，Zhou XJ，Liao SY.Erythropoietin enhances recovery from cisplatin-induced acute renal failure〔J〕.Am J Physiol,1994;266(3 Pt 2)：F360-6.

11Siddiqui S，Ahsan H，Khan MR，etal.Protective effects of tocotrienols against lipid-induced nephropathy in experimental type-2 diabetic rats by modulation in TGF-β expression〔J〕.Toxicol Appl Pharmacol,2013;273(2)：314-24.

12Sun YB，Qu X，Li X，etal.Endothelial dysfunction exacerbates renal interstitial fibrosis through enhancing fibroblast Smad3 linker phosphorylation in the mouse obstructed kidney〔J〕.PLoS One,2013;8(12)：e84063.

13Sun BK，Li C，Lim SW，etal.Expression of transforming growth factor-beta-inducible gene-h3 in normal and cyclosporine-treated rat kidney〔J〕.J Lab Clin Med,2004;143(3)：175-83.

14Ortiz A，Lorz C，Catalán M，etal.Cyclosporine A induces apoptosis in murine tubular epithelial cells：role of caspases〔J〕.Kidney Int Suppl,1998;68：S25-9.

15Gogusev J，Murakami I，Doussau M，etal.Molecular cytogenetic aberrations in autosomal dominant polycystic kidney disease tissue〔J〕.J Am Soc Nephrol,2003;14(2)：359-66.

16Li C，Lim SW，Sun BK，etal.Expression of apoptosis-related factors in chronic cyclosporine nephrotoxicity after cyclosporine withdrawal〔J〕.Acta Pharmacol Sin,2004;25(4)：401-11.

17Parsa CJ，Matsumoto A，Kim J，etal.A novel protective effect of erythropoietin in the infarcted heart〔J〕.J Clin Invest，2003;112(7)：999-1007.

18Yang CW，Li C，Jung JY，etal.Preconditioning with erythropoietin protects against subsequent ischemia-reperfusion injury in rat kidney〔J〕.FASEB J,2003;17(12)：1754-5.

19Yang CW，Ahn HJ，Kim WY，etal.Synergistic effects of mycophenolate mofetil and losartan in a model of chronic cyclosporine nephropathy〔J〕.Transplantation,2003;75(3)：309-15.

20Perico N，Dadan J，Remuzzi G.Endothelin mediates the renal vasoconstriction induced by cyclosporine in the rat〔J〕.J Am Soc Nephrol,1990;1(1)：76-83.