骨碎補總黃酮預處理轉CNTF成肌細胞修復兔橈骨缺損的效果

張 力 王 偉

(錦州市中心醫院 遼寧醫學院錦州臨床學院骨科，遼寧 錦州 121000)

骨缺損主要由創傷、炎癥、腫瘤的外科治療所導致，是引起功能喪失并影響生活質量的主要原因。其治療通常采用的是自體骨移植、同種異體骨移植、帶血供的游離骨移植和生物材料替代等方法〔1，2〕。理想的骨修復材料應通過骨形成、骨傳導作用和骨誘導作用三重機制促進骨的愈合并具有良好的生物相容性。自體來源的種子細胞或修復材料構建組織工程骨存在來源有限、體外需大量擴增、增加患者等待時間等不足〔3〕。目前，引導性骨再生已成為修復骨缺損的一種重要手段，其中微囊逐漸被用作骨科藥物和轉基因細胞的載體，在組織移植與骨缺損修復方面發揮積極的作用〔4〕。本實驗采用微囊化技術將經過基因轉染和中藥預處理的大鼠成肌細胞作為修復的材料，植入兔橈骨缺損處引導骨再生，驗證該材料的生物安全性，并為構建新型組織工程骨提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1動物 清潔新西蘭大白兔24只，體質量(2.3±1.5)kg，雌雄不限，由遼寧醫學院實驗動物中心提供(動物許可證號SCXK(遼)2003-2007)。

1.2實驗藥品及試劑 海藻酸鈉、多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；BMP-2因子(軍事醫學科學院)；醫用透明質酸鈉凝膠(HA凝膠)，上海其勝生物制劑有限公司；速眠新Ⅱ號(長春軍需大學獸醫研究所)；注射用青霉素鈉(規格：80萬單位，華北制藥股份有限公司)；注射用硫酸慶大霉素(規格：8萬單位，上海新先鋒藥業有限公司)。

1.3主要儀器及設備 倒置熒光顯微鏡(德國LEICA公司)、掃描電子顯微鏡(JSM-35CF型)(日本電子公司)、手術器械、醫用線鋸、7#醫用縫合線等(錦州市中心醫院手術室提供)、OLYMPUS顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、CAIS-1000圖像分析系統(瑞典LKB公司)

1.4方法

1.4.1AFDR預處理轉CNTF成肌細胞的制備及微囊化細胞的檢測 改良法體外分離培養大鼠成肌細胞，參照前期實驗結果，給予CNTF成肌細胞低劑量AFDR給藥濃度(67.5 mg·kg-1·d-1)〔5〕制備低濃度AFDR含藥血清。分別取經或未經AFDR預處理的轉CNTF成肌細胞，經干預后置換出微粒核心中的鈣離子獲得微囊化轉CNTF成肌細胞和微囊化AFDR預處理的轉CNTF成肌細胞。獲得微囊后于無菌培養皿中培養，加入DMEM培養液，倒置顯微鏡下觀察微囊化細胞形態。

1.4.2負載BMP的HA載體的制備及檢測 凍干BMP-2粉末與生理鹽水按50 mg∶1.5 ml的比例調成BMP-2混懸液，然后按0.45 ml∶1 ml的配比將BMP-2混懸液與HA凝膠混勻，制備成負載BMP-2因子的載體復合物，冷藏備用，按照前期實驗方法取部分標本掃描電鏡下觀察載體復合物形態〔6〕。

1.4.3實驗分組及動物模型構建 清潔新西蘭大白兔24只，根據處置條件隨機分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，每組6只動物，于左前臂造模，右前臂作正常對照組。

速眠新肌肉注射麻醉新西蘭大白兔，取前臂內側切開3 cm縱形切口，充分顯露橈骨中段，電鋸造成約15 mm節段骨缺損(帶骨膜)，造成公認的兔橈骨缺損模型。Ⅰ組注入1 ml負載BMP的HA凝膠，并于其中注入AFDR預處理轉CNTF成肌細胞微囊懸液50 μl(約200個微囊，細胞數約1×105)；Ⅱ組注入1 ml負載BMP的HA凝膠，并于其中注入轉CNTF成肌細胞微囊懸液50 μl(約200個微囊，細胞數約1×105)；Ⅲ組注入1 ml負載BMP的HA凝膠，并于其中注入生理鹽水50 μl；Ⅳ組植入1 ml HA凝膠，并于其中注入生理鹽水50 μl。

術后連續3 d給予青霉素、慶大霉素肌注預防感染，動物不予外固定，分籠飼養，不限制活動。

1.4.4動物術后大體及標本觀察 術后連續觀察兔的傷口愈合情況及其活動狀況，術后8、12 w分別處死2只動物取實驗側橈骨標本，觀察移植區大體標本的顏色、質地、血管形成、宿主骨界面和周圍軟組織覆蓋移植物等情況。

1.4.5組織學觀察 取術后12 w動物實驗側橈骨標本，10%多聚甲醛固定、10%硝酸脫鈣、石蠟包埋，然后連續橫行及縱行切片，切片厚度為5 μm，行HE染色，在100倍光鏡下觀察結合部及異體骨周圍骨愈合情況。

1.5統計學分析 采用SPSS16.0軟件行方差分析。

2 結 果

2.1微囊化細胞觀察及細胞存活率測定 倒置相差顯微鏡下見制備的細胞微囊大小比較均一，直徑500～800 μm，呈球形，邊界規整清楚，囊內細胞折光性強。約75%的微囊包含細胞，約50～100個/囊，其余為空囊，見圖1。

2.2負載BMP的HA載體掃描電鏡(SEM)觀察 實驗構建的HA凝膠載體有良好的組織相容性，可以制成一定的物理構形，負載BMP的HA凝膠載體可見BMP顆粒均勻附著于HA凝膠多孔結構中，可促進骨組織的再生，使新生骨的塑形和改建能夠順利完成(圖2)。

圖1 微囊化細胞形態觀察(倒置相差顯微鏡，×40)

圖2 負載BMP的HA凝膠(SEM，×1 000)

2.3動物術后觀察及大體標本觀察結果 Ⅲ組中有1只動物出現傷口感染延遲愈合，其余動物均飲食正常，均一期愈合，切口處縫線自行脫落。

術后8 w，Ⅰ、Ⅱ組骨缺損斷端組織融合良好，有較多硬度較高的類骨樣組織；Ⅲ組則僅見少量類骨質生成，其硬度不及Ⅰ、Ⅱ組；Ⅳ組植入物與宿主的界限清晰，表面僅有一層較致密的纖維組織膜包裹，仍有活動性。見圖3。

圖3 術后動物橈骨大體標本觀察

術后12 w，Ⅰ組骨缺損區與宿主骨融為一體，修復邊緣規整，新生骨直徑與鄰近宿主骨直徑相當；Ⅱ組出現連續性新骨生成，但直徑較細；Ⅲ組修復區骨直徑較小，修復后新骨塑形欠佳；Ⅳ組骨缺損區斷端只見少許新生骨，缺損區被纖維結締組織連接。見圖3。

2.4病理組織HE染色光鏡觀察結果 術后12 w，Ⅰ組植入物與宿主骨交界處骨小梁排列整齊被新生骨組織占據，皮質骨形成良好，缺損區編織骨轉化為板層骨，有大量骨陷窩(箭頭A示)、中央管(箭頭B示)形成；Ⅱ組骨小梁排列均勻，缺損區編織骨轉化為板層骨，可見大量成熟編織骨，骨小梁周圍成骨細胞(箭頭示)生長活躍；Ⅲ組呈均勻性成骨現象，軟骨細胞和少量多核細胞浸潤，但骨小梁、編織骨數量較前兩組差，偶可見哈佛斯系統(箭頭示)及中央管；Ⅳ組可見HA凝膠基本吸收，有大量纖維結締組織(箭頭示)、新生血管較少，邊緣可見少量骨組織和軟骨組織。見圖4。

圖4 術后12 w不同組兔橈骨缺損愈合情況(HE，×200)

3 討 論

引導性骨再生是組織工程學技術修復骨缺損的創新方法之一，改變了治療骨缺損的傳統治療模式，為骨缺損的修復重建提供了新的思路；而利用體外基因修飾技術，使細胞在骨缺損修復局部發揮成骨效應，是一種局部基因治療的概念。骨缺損的修復再生過程復雜，修復材料的選擇是修復的關鍵，我國已建立了多個同種異體骨庫，很多同種異體骨材料已廣泛應用于臨床，且獲得了滿意的臨床療效〔7，8〕。隨著組織工程學及中西醫結合醫學的發展，骨碎補廣泛應用于骨損傷修復，大量研究表明AFDR具有在體外促進成骨細胞分化的作用〔9〕，因此本實驗選擇微囊化AFDR預處理轉CNTF成肌細胞，即采用微囊化技術將經過基因轉染和中藥預處理大鼠成肌細胞使構建的組織工程骨兼具骨傳導性和骨誘導性，以更好地實現對骨缺損的修復。本實驗結果證明，微囊化細胞存活率良好，不僅未影響藥物和轉基因細胞的活性，應用于骨修復后，實驗動物存活良好，未發現不良反應。

骨總黃酮具有促進體外成骨細胞增殖、分化，抑制成骨細胞凋亡的作用，且在骨缺損過程中對血清堿性磷酸酶、鈣、磷及肌酐、谷丙轉氨酶水平產生影響，微囊則在移植部位保護了移植細胞避免受到局部血腫壓迫引發的損傷〔10〕。通過動物取材檢測可見Ⅰ、Ⅱ骨缺損處，不僅橋接部有成骨，并在成骨性因子BMP的作用下形成新骨，并形成新生骨痂形成，且各項檢測指標明顯優于BMP因子與HA凝膠復合組。

細胞因子結合功能細胞替代治療以及微囊化轉基因細胞移植在骨外科的研究越來越多，通過本研究觀察可見，在組織移植與骨損傷修復方面也發揮積極的作用。然而，本實驗也由于時間限制，在微囊化技術方面進作了初步的應用，未能進行長期觀察體內的遠期定植，需進一步深入探究。

4 參考文獻

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