帕金森病小鼠黑質紋狀體小膠質細胞活化表達的炎性因子與多巴胺含量的關系

王 蓉 歐陽敏 張 萍 王 瓊

(中南大學湘雅二醫院老年病科，湖南 長沙 410011)

帕金森病(PD)是老年人常見的神經系統變性疾病，60歲以后發病率高，嚴重影響老年人的生活質量〔1〕。中腦黑質致密帶多巴胺能神經元缺失是其主要病理特征之一。自從在PD患者的中腦黑質致密帶中發現了激活的小膠質細胞(MG)以來，以MG激活為特征的神經免疫炎癥機制受到了普遍關注。本文研究PD小鼠活化MG釋放的炎癥因子與黑質紋狀體多巴胺含量之間的關系。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑 雄性健康C57BL/6小鼠40只，體重22～28 g，由中南大學湘雅二醫院實驗動物中心提供。適應性喂養1 w，供以充足的食物和水，正常光照周期。前列腺素E2(PGE2)兔抗鼠多克隆抗體、腫瘤壞死因子(TNF)-α兔抗鼠多克隆抗體、白介素(IL)-1β兔抗鼠多克隆抗體(北京博奧森生物工程有限公司，中國)，生物素化二抗(福州邁新公司)，碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液(實驗室配制)，SABC試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，中國)，百草枯(PQ，上海科興實驗室設備有限公司，中國)，NO試劑盒(上海碧云天生物技術研究所，中國)。

1.2方法

1.2.1分組 40只小鼠隨機分為：模型組(n=20)：將百草枯(10 mg/kg)溶于5 ml生理鹽水配制成溶液，腹腔注射，2次/w，連續6 w。對照組(n=20)：給予等體積生理鹽水，2次/w，連續6 w。分別觀察小鼠行為學變化，行旋轉實驗。兩組均在腹腔注藥后3、6 w時各處死10只小鼠。

1.2.2行為學檢測 腹腔注藥后第2、4、6周進行旋轉行為測試。腹腔注射阿樸嗎啡0.5 mg/kg,10 min后開始觀察并記錄大鼠的旋轉行為，共記錄30 min，小鼠旋轉時以健側后肢為支點原地旋轉，身體環曲，首尾相接360 °為1轉(r)，旋轉>7 r/min或 210 r/30 min為成功PD模型。

1.2.3高效液相色譜檢測小鼠黑質紋狀體多巴胺含量 小鼠水合氯醛麻醉后取雙側黑質、紋狀體，加入0.1 mol/L的高氯酸0.85 ml，研磨后上清于4℃低溫10 000 r/min離心30 min，取上清液，0.22 μm的濾膜過濾行高效液相檢測。參照峰值面積計算其測定值，以計算值/腦組織濕質量(μg/g)表示。

1.2.4TNF-α、IL-1β、PGE2表達、MG測定 SABC法對黑質致密部行切片染色，檢測TNF-α、IL-1β、PGE2表達和計數MG胞數：石蠟切片常規脫蠟至水后，PBS洗3次×3 min。將切片浸入0.01 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)，電爐加熱至沸騰后斷電冷卻5～10 min，反復1～2次。冷卻后PBS洗滌1～2次。滅活內源性酶，蒸餾水洗3次。滴加5%正常羊血清封閉，滴加適量稀釋過的兔抗鼠一抗，滴加生物素化羊抗兔二抗，室溫下孵育60 min。PBS洗3次×3 min。添加試劑SABC復合物室溫孵育60 min，蘇木素輕度復染。梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。顯微鏡下觀察，切片選取5個不重復高倍(40×10)視野，2人采用盲法分別計算陽性細胞數。而MG切片必須來自過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液處理的標本。常規脫蠟入水后，處理方式與常規切片基本相同。光鏡下，隨機選取5個視野(10×40)，2人采用盲法進行黑質致密部MG計數。

1.2.5NO的測定 亞硝酸鹽作為NO穩定的氧化產物，通過溶液中的NO2-可與對氨基苯磺酸和N-(1-奈基)-乙二胺偶聯，生成紫紅色產物，該產物在550～570 nm處存在較大吸收峰，將溶液在540 nm處比色，吸光度值的大小與NO2-的含量成正比，據此可檢測NO的生成量。

1.3統計學方法 采用SPSS11.0統計學軟件對計量資料數據進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組小鼠PD行為學檢測 模型組小鼠腹腔注射PQ后10～14 d有12只出現行動遲緩、 少動、嗅探等異常行為，在4 w后的阿樸嗎啡誘導的旋轉行為檢測證實其中的16只大鼠出現旋轉行為，這說明紋狀體-黑質通路已經受到損害，表明建模成功，成功率為80%。對照組大鼠無異常行為發生。

2.2小鼠黑質紋狀體多巴胺含量 腹腔注藥3、6 w后模型組小鼠腦內多巴胺含量分別為(7.68±0.67)、(4.23±0.31)μg/g，均較對照組明顯減少〔(12.36±1.08)、(12.84±1.12)μg/g,P< 0.05〕。

2.3各組小鼠黑質致密部MG計數 腹腔注藥3 w后模型組小鼠黑質致密部MG數(38.50±3.23)與對照組(36.33±3.36)無明顯差異(P>0.05)，6 w后模型組小鼠黑質致密部MG數(54.33±4.46)較對照組(38.80±3.42)明顯增加(P<0.05)。

2.4小鼠黑質部TNF-α、IL-1β和PGE2表達 腹腔注藥3 w后模型組TNF-α和IL-1β表達陽性細胞與對照組比較，差異均無顯著性(P>0.05)，6 w后模型組TNF-α和IL-1β陽性細胞較對照組均明顯增加(P<0.05)，腹腔注藥3 w和6 w后模型組PGE2表達陽性細胞與對照組比較，差異均無顯著性(P>0.05)。見表1。

表1 小鼠黑質部TNF-α、IL-1β和PGE2陽性細胞

2.5小鼠黑質部NO表達 腹腔注藥3、6 w后模型組NO表達陽性細胞(12.6、11.8)μmol/L與對照組(11.5、11.2)μmol/L比較，差異均無顯著性(P>0.05)。

3 討 論

PD的發病機制尚不明確，多認為可能與老化、遺傳和環境等因素有關。近年研究發現，以MG過度激活為特征的神經免疫炎癥反應在PD的發病中發揮了重要作用。MG來源于間充質中胚層的巨噬細胞，形態上主要分為分枝狀和阿米巴狀，前者為未被激活的MG，后者為阿米巴狀。未被激活的MG具有吞飲功能和一定的遷移能力，且廣泛而規律的分布在腦內，對腦組織的代謝產物起到了凈化的作用。但它們對一些信號分子能迅速做出應答，并對細胞微環境的變化非常敏感。研究顯示小膠質細胞的激活可能與其有CNS信號分子(ATP、CGRP、Ach等)的膜受體，膜通道(如鉀離子通道)，細胞內信號傳導途徑(PTK、PLA2等)和細胞內轉錄因子的激活等有關。受刺激后可迅速激活，具有變形和吞噬作用，并具有免疫監視功能；受外界環境刺激后，MG在形態改變的同時,其功能也發生了改變,細胞表面表達CR3補體受體和主要組織相容性復合物的分子水平上調，合成和分泌細胞因子的速度加快，如TNF-α，IL-1β等，這些細胞因子又可激活MG，使其釋放大量炎性因子，通過MG的激活分泌炎性因子調節微環境有其有利的一面，但持續地激活只能導致神經元損傷和變性，其中的具體原因仍不清楚。但均認為MG激活在PD發生、發展的各個階段中均具有重要意義〔2〕。研究顯示PQ可經血腦屏障主動至中樞神經系統，病理提示PQ誘導的動物模型病理結果顯示中毒的小鼠黑質部位處于嚴重的氧化應激狀態，氧自由基大量生成，致使腦組織有大量壞死空腔，且與海馬神經元的損傷呈相關性，這種氧化應激引起了某些PD相關基因表達的變化〔3～5〕。

以往學者研究發現在早期PD患者中，膠質增生與神經元死亡具有相關性，MG可由神經元的退變壞死所激活，一旦激活，會釋放大量細胞因子，使多巴胺能神經元抗氧化損傷的能力明顯下降，而氧化應激損傷又引起了某些PD相關基因表達的變化，激活的MG數明顯增高，且同時伴有多巴胺能神經元的丟失；MG的激活可能主動參與了多巴胺神經元變性過程〔6～8〕。表達TNF-α和IL-1β的MG密度在PD患者的黑質中增加，且有研究證實在脂多糖處理的小鼠中腦原代培養體系中，發現有MG的激活和細胞因子(TNF-α、IL-1β)表達的升高，伴隨有多巴胺能神經元的死亡。本研究結果印證了既往動物實驗結論，MG的高度激活和數目增多參與PD的發病過程〔10〕。PGE2由COX-2表達，在有關PD模型中COX-2表達PGE2量減少可有效減少MG的激活，從而保護了因過度炎性反應引起的多巴胺神經元受免疫性損傷。與本實驗結果不同，本研究認為PGE2的表達與PD無明顯相關性，但仍需進一步擴大試驗樣本研究明確機制。文獻顯示NO是一種活性因子，在病變早期由于高濃度的NO導致產生谷氨酸鹽，誘導線粒體受損傷，最終導致神經元的死亡。本實驗推測NO參與了早期中樞神經系統病理改變，隨病情的發展，表達水平回歸正常。

綜上，模型組小鼠黑質致密部MG增生、激活，分泌炎性因子TNF-α和IL-1β，后兩者介導對神經元的攻擊作用，加速了神經元的變性和死亡，是導致PD患者發病的重要環節之一。可以此為切入點進行更深入的研究，從而改善PD的臨床治療。

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