鹿角多肽對H2O2誘導MG63氧化損傷的保護作用

李 娜 曲曉波 李 晶 律廣富 楊 擎 常志達 張婧卓 王曉琴 王賀彬 林 喆

(長春中醫藥大學研發中心藥理實驗室，吉林 長春 130117)

鹿角膠為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的角煎熬而成的膠塊，《本草匯言》記載“鹿角膠，壯元陽，補血氣，生精髓，暖筋骨”，具有溫補肝腎、強筋壯骨、活血消腫的作用，可治療腰脊冷痛、陰疽瘡瘍、乳癰突起和癖血腫痛等癥〔1，2〕。骨質疏松(OP)是一種以骨密度下降和骨微結構破壞為特征，造成骨強度下降，骨脆性增加和易發生骨折的代謝性骨病〔3〕。現代藥理研究表明鹿角膠具有抗OP的作用〔4〕，為了進一步探討鹿角膠對OP的治療作用。本文從細胞水平研究鹿角多肽(AP)對成骨細胞MG63氧化應激造成的影響，初步探討其對成骨的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1細胞株、主要試劑及儀器 人成骨肉瘤細胞株MG63由省腫瘤醫院中心實驗室提供，胎牛血清、1640培養基和胰蛋白酶均購于GibcoBRL 公司。梅花鹿角(購于吉林省長春市雙陽區鹿鄉鎮)，按照傳統方法制備得到鹿角膠，提取率為29.3%，取熬制的鹿角膠加入檸檬酸和胃蛋白酶，37℃下酶解，上清液進行鹽析，然后透析(透析袋為2000)，凍干得AP，提取率為4.86%。兔抗人骨形態發生蛋白(BMP-2)抗體、羊抗兔二抗購于Pe-protech公司，二氯基聯基胺(DAB)KIT顯色試劑盒(福州邁新生物技術開發有限公司)。超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)均購自于南京建成生物工程研究所。CO2培養箱購自Thermo公司，550型酶標儀購自美國BIO-RAD 公司，Leica石蠟切片機，Leica攤片機，Leica包埋機均為德國Leica 公司產品。倒置熒光顯微鏡(IX-8)購自日本Olympus公司。

1.2MG63細胞培養 將MG63細胞置于含有10%胎牛血清和青鏈霉素各100 U/Ml培養基，置于37℃、5% CO2的細胞培養箱內常規培養，待細胞長致80%融合時進行后續實驗。

1.3分組及給藥 取對數生長期的MG63細胞隨機分成空白組：連續用培養液培養；H2O2損傷模型組：先用正常培養液培養48 h，再加入H2O2(濃度為0.5 mmol/L)，培養4 h；AP組：AP(0.1、0.15、0.1、0.05和0.01 mg/ml)培養48 h后，再加入H2O2損傷4 h(濃度為0.5 mmol/L)后進行檢測。

1.4四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定細胞活力 將細胞接種于96孔板，每孔5×104個/ml的細胞懸浮液100 μl、培養12 h完全貼壁，按1.3分組，模型組先用培養基培養48 h，給藥組用AP處理48 h后，模型組和AP組用H2O2(0.5 mmol/L，4 h)處理，每孔20 μl加入MTT，4 h后甩板，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)使其顯色，顯色后振動孵育10 min，使結晶溶解完全，酶標儀490 nm測吸光度值(OD值)。

1.5HE染色 將細胞用胰酶消化后，調整細胞濃度約1×105/ml，接種于6孔板(內置無菌蓋玻片)內。待細胞融合達到70%時，按照1.3分組及給藥，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，甲醇固定30 min，PBS洗滌2次，加入Von Kossa 液染色30 min，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察拍照。

1.6免疫組織化學法檢測細胞中BMP-2的蛋白水平 細胞爬片方法同1.5，去除固定液，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%TritonX100 作用20 min，加入BMP-2 抗體(1∶50稀釋)，室溫作用1 h，二抗用PBS稀釋200倍，辣根酶標記。DAB顯色，HE復染。于熒光倒置顯微鏡觀察。

1.7檢測細胞上清液中SOD、MDA、LDH含量 按照1.3方法將細胞接種于6孔板，棄上清，用PBS沖洗3次，加入0.2 ml 裂解液，用刮刀將細胞刮下，移至EP管中，13 000 r/min離心30 min，收集上清按試劑盒要求，檢測細胞上清液中SOD、MDA、LDH的含量。

2 結 果

2.1AP對氧化損傷MG63細胞活力的影響 與空白組(1.04±0.01)比較，模型組(0.81±0.03)細胞活力明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，AP給藥組的細胞生存率明顯升高，最佳給藥濃度為0.05 mg/ml(0.97±0.05)(P<0.01)。其中0.1 mg/ml組OD值為(0.92± 0.05),0.15 mg/ml組OD值(0.91±0.04)；0.01 mg/ml組OD值(0.93±0.03)。

2.2AP對氧化損傷MG63細胞HE染色結果 空白組細胞核細胞質染色對比分明，細胞核多為類圓形，H2O2損傷模型組細胞部分皺縮，細胞核暗淡，偽足消失；AP(0.05 mg/ml)組細胞損傷程度減輕，細胞核折光性較模型組好，偽足略變細。見圖1。

2.3BMP-2蛋白免疫組織化學染色的結果 免疫組織化學染色顯示，BMP-2在MG63細胞質中呈褐色表達，與模型組比較，空白組和AP組細胞胞漿內分布著棕黃色顆粒，呈明顯陽性。見圖2。

空白組 模型組 AP組

空白組 模型組 AP組

2.4氧化損傷MG63細胞SOD、MDA、LDH的活性測定 模型組與空白組比較均具有統計學意義(P<0.01)，H2O2可使MDA的含量明顯增高，SOD活性降低；AP組與模型組比較，AP可抑制MDA的活性(P<0.05)，并減輕LDH從MG63細胞中的漏出量(P<0.01)，并可顯著升高SOD含量(P<0.01)。見表1。

表1 AP對H2O2氧化損傷MG63分泌SOD、MDA、LDH的影響

3 討 論

OP主要是由于破骨細胞的骨吸收與成骨細胞的骨形成動態平衡被打破，其中氧化應激是導致成骨細胞形成減少、功能減退的主要因素之一〔5〕。人成骨肉瘤MG63細胞株具有成骨細胞的大部分特征，被廣泛應用于OP的基礎研究。鹿角膠具有壯元陽，補血氣，生精髓，暖筋骨的功效，在前期研究中發現鹿角膠具有抗OP和抗衰老的作用〔4〕。

BMP-2為一分子量20 000左右的酸性多肽，是具有特殊生物學活性的細胞生長因子，是目前已知的對骨形成作用較強的生長因子之一。BMP-2能誘導未分化的間充質細胞經過趨化期、分化期、骨質形成及重塑期4個環節不可逆分化為軟骨細胞和成骨細胞〔6，7〕，并協同其他調節因子參與骨形成，是骨修復過程中不可缺少的骨誘導蛋白。H2O2能夠引起成骨細胞的氧化損傷，減少成骨細胞的數量，提高破骨細胞的活性，直接參與骨基質的降解，可以認為氧化損傷參與和加速了OP的病理過程。同時引發脂質過氧化作用，其結果是自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸，裂解生成脂質過氧化終產物MDA，因此，測定MDA能較好地反映脂質過氧化水平，間接地反映出細胞損傷的程度〔8〕。SOD是體內氧自由基的清除劑之一，通過催化消除超氧陰離子自由基阻礙氧自由基的產生，保護細胞的正常功能，它是一種廣泛存在于生物體內與細胞氧代謝密切相關的酶，因此測定SOD的活力可間接反映體內自由基的產生和毒物對細胞的損傷情況，亦可反映組織內清除自由基的能力〔9，10〕。LDH屬于氧化還原類酶，主要分布于細胞的胞質液中,是生物體細胞內參與糖代謝過程的一種重要酶，參與機體的能量代謝，LDH量的改變,直接影響到機體的能量代謝，反映了細胞的活力。

本研究結果顯示，AP能夠促進氧化損傷成骨細胞MG63的增殖，使細胞胞漿飽滿，細胞核大呈圓形，核仁清晰,并能促進細胞中BMP-2蛋白的表達，保護氧化損傷的成骨細胞。同時提示AP能改善氧化應激產物的數量，降低脂質過氧化物含量，增強細胞內SOD的活性，保護氧化損傷的成骨細胞，調節BMP-2表達促進骨形成。

4 參考文獻

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4蒙海燕,曲曉波,李 娜,等.鹿茸及鹿角膠對去卵巢大鼠骨質疏松的影響〔J〕.中藥材,2009；32(2):179-81.

5Xu ZS,Wang XY,Xiao DM,etal..Hydrogen sulfide protects MC3T3-E1 osteoblastic cells against H2O2-induced oxidative damage-implications for the treatment of osteoporsis 〔J〕.Free Radic Biol Med,2011；50(10):1314-23.

6Tsuchida H，Hashimoto J，Crawford E，etal.Engineered allogeneic mesenchymal stem cells repair femoral segmental defect in rats 〔J〕 .J Orthop Res，2003；21(1)：44-53.

7趙 春,張艷紅,謝煥松,等.杜仲對去勢大鼠骨細胞及骨髓間充質干細胞BMP-2表達的調節作用〔J〕.四川中醫,2009；27(8):24-7.

8Gawel S,Wardas M,Niedworok E,etal.Malondialdehyde(MDA) as a lipid peroxidation marker〔J〕.Wiad Lek，2004；57(9-10):453-5.

9劉 雷,郭元暉,辛海量,等.仙茅苯甲酸酯類酚苷對去卵巢骨質疏松大鼠的作用〔J〕.中西醫結合學報,2012；10(12):1419-26.

10楊希重,季翠杰,王德春,等.去卵巢骨質疏松模型大鼠的番茄紅素干預〔J〕.中國組織工程研究,2012；16(15):2750-66.