丹參酮ⅡA對人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞增殖及誘導凋亡的作用

李 沫 陳立強 孔慶濱

(東北林業大學醫院皮膚科，黑龍江 哈爾濱 150040)

老年人群皮膚鱗狀細胞癌發病率呈逐年上升趨勢〔1〕。丹參酮(Tan)ⅡA是從中藥丹參中提取的脂溶性有效成分，對多種腫瘤細胞的增殖抑制和誘導凋亡有重要的調節作用〔2〕。但TanⅡA對人皮膚鱗狀細胞癌作用研究尚未見報道。本研究體外觀察TanⅡA對A431細胞的生長抑制和誘導凋亡影響，探討其抗皮膚鱗狀細胞癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1細胞和主要試劑 人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株(中國協和醫科大學)；TanⅡA(中國生物制品檢定所，純度≥98%)；二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑鹽(MTT)和DMSO(Sigma公司)；IMDM培養液和胎牛血清(GIBCO公司)；碘化丙啶(PI)和AnnexinV-FITC(BD公司)。

1.2細胞培養 A431細胞株接種于含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的IMDM培養液中，置于37℃、5% CO2細胞培養箱中培養，48～72 h傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.3細胞增殖抑制試驗(MTT法) 取對數生長期細胞接種于96孔板，繼續培養24 h后，分為實驗組、空白對照組，實驗組分別加入終濃度為0.5、1、2.5、5、10 μg/ml TanⅡA的 IMDM培養液100 μl，空白對照組加入等體積的不含TanⅡA的IMDM培養液。每個濃度設6個復孔，分別作用24、48、72 h后，加入新配置的MTT液，再培養4 h后，加入DMSO溶液，震蕩搖勻，使結晶充分溶解，置酶標儀上測各孔吸光度值(A570 nm)，取6個復孔的平均值，根據公式計算細胞抑制率，抑制率=(1-實驗組平均A570 nm值/對照組平均A570 nm值)×100%。

1.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集不同濃度TanⅡA(0、2.5、5、10 μg/ml)作用48 h的各組細胞，制成單細胞懸液，加Annexin V-FITC與PI雙標記活細胞，混勻后室溫下避光孵育15 min，再加入1×結合緩沖液充分混合后于流式細胞儀上檢測細胞凋亡情況，應用Multicycle AV軟件進行凋亡細胞分析。

1.5統計學分析 使用SPSS19.0統計軟件進行單因素方差分析和兩兩比較LSD檢驗。

2 結 果

2.1TanⅡA對A431細胞增殖的影響 不同濃度的TanⅡA作用于A431細胞后，細胞生長受到不同程度的抑制，各濃度組與空白對照組差異均有統計學意義(P<0.01)。0.5 μg/ml組和1.0 μg/ml組TanⅡA對A431細胞作用24 h生長抑制率差異不明顯(P>0.05)；其余各組在作用時間相同時，隨著藥物濃度的增加，對A431細胞增殖抑制率有明顯增加，各濃度組兩兩比較有統計學差異(P<0.05)；在同一藥物濃度時，隨著作用時間的延長，TanⅡA對A431細胞增殖抑制率也有明顯差異(P<0.05)。見表1。

2.2TanⅡA對A431細胞凋亡的影響 2.5、5.0、10.0 μg/ml組細胞凋亡率(1.31%±0.41%、3.73%±0.74%、6.57%±0.58%)均明顯高于空白對照組(0.26%±0.09%)(P<0.01)。細胞凋亡率隨著TanⅡA濃度增加而上升(P<0.05)。見圖1。

表1 各組A431細胞體外增殖抑制率比較

圖1 TanⅡA對A431細胞凋亡的影響

3 討 論

腫瘤細胞的增殖及凋亡異常是導致腫瘤形成、發展的關鍵原因之一。有效抑制腫瘤細胞增殖和促進腫瘤細胞的凋亡是臨床應用藥物治療腫瘤的思路之一。TanⅡA是從中藥丹參中提取的有效成分，具有一定的抗腫瘤作用，諸多研究者在肺癌〔3〕、鼻咽癌〔4〕、乳腺癌〔5〕、白血病〔6〕等惡性腫瘤的體外細胞實驗中證實TanⅡA具有抑制腫瘤細胞增殖和誘導腫瘤細胞凋亡的作用。本研究也發現，TanⅡA對體外培養的人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞具有明顯的生長抑制作用，并能夠誘導其凋亡，且具有劑量時間依賴性。

本研究結果表明TanⅡA對于A431細胞的抑制效應有明顯的劑量依賴性。TanⅡA對于A431細胞的抑制效應有明顯的時間和濃度依賴性。其作用機制可能與TanⅡA阻滯A431細胞周期和(或)上調了細胞內部分凋亡相關基因的表達有關，但其具體的作用機制尚需進一步研究。

4 參考文獻

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